Péstisida maénkeun peran penting dina ngungkulan kakurangan pangan global sareng merangan panyakit manusa anu ditularkeun ku vektor. Nanging, masalah résistansi péstisida anu terus ningkat sacara gancang meryogikeun kapanggihna sanyawa énggal anu narékahan target anu kurang dianggo. Saluran poténsial reséptor transient serangga (TRPV)—Nanzhong (Nan) sareng teu aktip (Iav)—tiasa ngabentuk saluran heterolog (Nan-Iav) sareng terlokalisasi ka organ mékanosensori anu ngamediasi geotropisme, dédéngéan, sareng propriosépsi dina serangga. Sababaraha péstisida, sapertos aphidopyrrolidone (AP), narékahan Nan-Iav ngalangkungan mékanisme anu teu dipikanyaho. AP épéktip ngalawan serangga anu nyeuseup (hemipteran), nyegah tuang ku cara ngaganggu fungsi filamén. AP ngan ukur tiasa ngabeungkeut Nan, tapi ngan ukur Nan-Iav anu tiasa berinteraksi sareng agonis, kalebet nikotinamida éndogén (NAM), sahingga nunjukkeun aktivitas saluran. Sanaos poténsi Nan-Iav salaku target inséktisida, sakedik anu dipikanyaho ngeunaan perakitan saluranna, situs pangiket pangaturan, sareng pangaturan anu gumantung kana Ca2+, anu ngahalangan pamekaran inséktisida salajengna. Dina ieu panilitian, mikroskop krio-éléktron dianggo pikeun nangtukeun struktur Nan-Iav dina serangga Hemiptera dina kaayaan bébas calmodulin-ligan, ogé sareng AP sareng NAM dina wates domain sitoplasmik (ARD) ankyrin repeat. Anu matak héran, urang mendakan yén protéin Nan sorangan tiasa ngabentuk pentamer, anu distabilisasi ku interaksi ARD anu dimediasi AP. Panilitian ieu ngungkabkeun interaksi molekuler antara inséktisida sareng agonis sareng Nan-Iav, anu nyorot pentingna ARD dina fungsi sareng perakitan saluran, sareng ngajalajah mékanisme pangaturan Ca2+.
Kalayan latar tukang parobahan iklim global anu beuki parah, kaamanan pangan global anu beuki buruk mangrupikeun salah sahiji tantangan utama abad ka-21, kalayan akibat anu terus-terusan pikeun masarakat.1,2Laporan Kaayaan Kaamanan Pangan sareng Nutrisi di Dunya 2023 (SOFI) Organisasi Kaséhatan Dunia ngira-ngira yén sakitar 2,33 milyar jalmi di sakumna dunya ngalaman kerawanan pangan sedeng dugi ka parah, masalah anu parantos lami lumangsung.3,4Hanjakalna, diperkirakeun 20% dugi ka 30% atanapi langkung tina hasil panén leungit unggal taunna kusabab hama sareng patogén, sareng pemanasan global diperkirakeun bakal ngajantenkeun résistansi hama sareng karéntanan panén langkung parah.4,5,6,7,8Pangwangunan péstisida penting pisan teu ngan ukur pikeun ngajaga pepelakan tina hama sareng ngirangan panyebaran patogén anu ditularkeun ku vektor, tapi ogé pikeun merangan panyakit manusa anu ditularkeun ku vektor sapertos demam berdarah, malaria, sareng panyakit Chagas, anu beuki tahan kana péstisida.5,9,10,11
Di antara target utama inséktisida neurotoksik, saluran TRPV heterotetramerik Nanchung (Nan)-Inaktif (Iav) ngawakilan kelas target inséktisida anu ngan kapanggih dina dasawarsa ka tukang, kalebet inséktisida anu sayogi sacara komersil sapertos imidacloprid sareng pyraclostrobin.12,13,14Inséktisida semisintétik aphidopyrrolifen (AP) nyaéta produk anu nembe dikembangkeun sareng dikomersialkeun anu komponén utamina nyaéta inséktisida aktif Inscalis®, anu ngabeungkeut AP dina tingkat aktivitas subnanomolar.15AP némbongkeun toksisitas akut anu handap pikeun penyerbuk, serangga anu mangpaat, sareng organisme non-target anu sanés, sareng nalika dianggo numutkeun pitunjuk labél, éta tiasa ngirangan tekanan résistansi kana inséktisida sanés.16,17,18Nan sareng Iav sumebar lega di sakumna spésiés serangga, ngan ukur diekspresikeun babarengan dina neuron reséptor regang kordal dina anteneu sareng anggota awak, sareng penting pisan pikeun pangrungu, persépsi gravitasi, sareng propriosépsi.13,16,19,20,21,22AP, imidacloprid, sareng piraclostrobin ngarangsang kompleks Nan-Iav ngaliwatan mékanisme anu unik, anu pamustunganana ngahalangan transduksi sinyal proprioseptif.13,16,23Dina serangga anu nyeuseup nu nyucuk (hemipteran) sapertos kutu daun sareng laleur bodas, leungitna propriosépsi ngaganggu kamampuan tuangna, anu pamustunganana ngabalukarkeun maot.13,24Anu pikaresepeun, AP némbongkeun afinitas anu luhur pikeun kompleks Nan-Iav sareng afinitas anu handap pikeun Nan nyalira. Pangiketna AP ka Nan-Iav ngainduksi arus listrik, tapi pangiketna kana Nan nyalira henteu ngarangsang aktivitas saluran. Iav sorangan henteu ngaiket kana AP pisan.16Ieu nunjukkeun yén Nan sareng Iav tiasa ngabeungkeut pikeun ngabentuk kompleks saluran Nan-Iav anu béda (contona, kalayan babandingan stoikiometri anu béda atanapi susunan anu béda dina babandingan stoikiometri anu sami) atanapi yén AP tiasa ngabeungkeut kana sababaraha situs. Salajengna, agonis nikotinamida alami (NAM) ngabeungkeut Drosophila Nan-Iav kalayan afinitas mikromolar, nunjukkeun épék anu sami sareng kutu daun (AP) in vitro.16,25sarta ngahalangan baranahan jeung dahar kutu daun, nu pamustunganana ngabalukarkeun maotna25,26Data ieu nimbulkeun seueur patarosan. Salaku conto, masih teu jelas kumaha heterodimer Nan-Iav kabentuk, situs pangiket mana anu dianggo pikeun ngamodulasi molekul leutik, sareng kumaha molekul leutik ieu ngatur fungsi saluran ku cara ngurangan proprioception. Salajengna, alesan kunaon Nan sorangan teu aktip sareng gaduh afinitas anu handap pikeun AP, sedengkeun heterodimer Nan-Iav aktip sareng ngabeungkeut AP kalayan afinitas anu langkung luhur, masih teu jelas. Pamungkas, sakedik anu dipikanyaho ngeunaan pangaturan fungsi Nan-Iav anu gumantung kana Ca2+ sareng kumaha éta diintegrasikeun kana prosés sinyal neuronal.. 13,21
Dina ieu panilitian, anu ngagabungkeun mikroskop krio-éléktron, éléktrofisiologi, sareng téknik pangiket radioligand, kami ngajelaskeun rakitan Nan-Iav sareng mékanisme pangiketna kana régulator molekul leutik. Salajengna, kami ngadeteksi calmodulin (CaM) anu kaiket sacara konstitutif kana Iav sareng pentamer Nan anu distabilisasi AP. Hasil ieu nyayogikeun wawasan penting kana pangaturan ion kalsium dina saluran, rakitan saluran, sareng faktor anu nangtukeun afinitas pangiket ligan. Anu langkung penting, kami mastikeun yén ARD maénkeun peran sentral dina prosés ieu. Panilitian kami ngeunaan saluran serangga lengkep anu kaiket kana péstisida tatanén anu relevan27, 28, 29muka prospek pikeun kamekaran industri péstisida, ningkatkeun éféktivitas sareng spésifisitas péstisida, sareng ngamungkinkeun aplikasi sanyawa anu ditujukeun TRPV ka spésiés sanés pikeun ngungkulan kaamanan pangan global sareng panyebaran panyakit anu ditularkeun ku vektor.
Kami ogé mendakan yén Nan-Iav diatur ku Ca2+, sareng mékanisme pangaturanana dimediasi ku CaM anu kaiket sacara konstitutif. Anu penting, pangaturan Nav ku CaM anu gumantung kana Ca2+ ieu béda sacara signifikan sareng mékanisme pangaturan saluran ion anu sanés (contona, saluran Na+ anu dijaga tegangan sareng saluran TRPV5/6)52,53,54,55,56,57Dina saluran Nav1.2, domain C-terminal CaM sacara heliks ngaasosiasi sareng domain C-terminal (CTD), sareng Ca2+ ngainduksi beungkeutan domain N-terminalna kana bagian distal CTD.56Dina saluran TRPV5/6, domain C-terminal CaM ngabeungkeut CTH, sareng Ca2+ ngainduksi ekstensi ka luhur tina domain N-terminalna kana pori, sahingga ngahalangan permeabilitas kation.53,54. Kami ngajukeun modél pikeun fungsi Nan-Iav-CaM anu diatur ku Ca2+ (Gambar 4h). Dina modél ieu, domain N-terminal CaM sacara konstitutif ngabeungkeut kana domain C-terminal (CTH) Iav. Dina kaayaan istirahat (konsentrasi [Ca2+] anu handap), domain C-terminal CaM berinteraksi sareng Nan, ngastabilkeun konformasi ARD sareng ku kituna ningkatkeun pambukaan saluran. Pangiket agonis/inséktisida kana saluran ngainduksi pambukaan pori, anu ngarah kana asupan Ca2+. Ca2+ teras ngabeungkeut kana CaM, nyababkeun disosiasi domain C-terminal tina ARD Nan. Kusabab ngahalangan pangiket CaM sacara dasarna ngaleungitkeun pangaruh inhibisi Ca2+, disosiasi ieu ngamodulasi mobilitas ARD, ku kituna nyababkeun inhibisi atanapi desensitisasi anu gumantung kana Ca2+. Pamulihan gancang arus saluran saatos élusi ion kalsium (Gambar 4g) nunjukkeun yén mékanisme ieu ngagampangkeun réspon gancang kana sinyal neuronal anu dimediasi ku Ca2+. Salajengna, daérah C-terminal Iav, anu masih kurang kahartos, parantos dilaporkeun maénkeun peran sanés dina targeting saluran sareng pangaturan ayeuna.21
Pamungkas, panilitian kami nampilkeun struktur résolusi luhur tina kompleks saluran TRP inséktisida-inséktisida anu penting pikeun tatanén—panemuan anu sateuacanna teu dipikanyaho ku kami. Anu penting, kami ngacirikeun struktur sareng fungsi saluran serangga dina sél manusa (HEK293S GnTi–) tinimbang dina sél serangga. Dina nyanghareupan résistansi inséktisida anu ningkat sareng tekanan anu terus-terusan kana kaamanan pangan sareng patogén, panilitian kami nyayogikeun inpormasi penting anu bakal ngagampangkeun pamekaran inséktisida énggal pikeun kauntungan kaséhatan manusa sareng kaamanan pangan global. Panilitian parantos nunjukkeun yén inséktisida sapertos AP épéktip ngalawan sababaraha hama nalika dianggo numutkeun pitunjuk labél sareng gaduh toksisitas akut anu handap pikeun penyerbuk anu mangpaat, nunjukkeun kaamanan lingkunganana.13,16Salajengna, uji coba sababaraha turunan AP dina reungit nunjukkeun yén aranjeunna tungtungna kaleungitan kamampuan pikeun ngapung. Ngartos kumaha sanyawa modulasi ieu ngabeungkeut Nan-Iav bakal ngagampangkeun modifikasi sanyawa anu tos aya atanapi pamekaran sanyawa énggal pikeun anu langkung efektif sarengtepatpangendalian hama. Panilitian kami nunjukkeun yén antarmuka ARD Nan-Iav penting pisan henteu ngan ukur pikeun ngatur aktivitas sanyawa éndogén, péstisida, sareng Ca2+-CaM, tapi ogé pikeun perakitan saluran. Kami nyarankeun yén ngaganggu perakitan heterodimer ku molekul leutik tiasa janten pendekatan anu unik sareng ngajangjikeun pikeun ngembangkeun inhibitor saluran ion.
Tina dalapan gén ortolog, gén panjang pinuh kumbang coklat (Halyomorpha halys) Nanchung sareng Inactive dipilih, nunjukkeun stabilitas anu saé dina deterjen. Gén anu disintésis dioptimalkeun kodon pikeun éksprési manusa sareng diklon kana véktor pBacMam pCMV-DEST (Life Technologies) nganggo situs réstriksi XhoI sareng EcoRI. Ieu mastikeun yén klon aya dina pigura sareng tag C-terminal GFP-FLAG-10xHis sareng mCherry-FLAG-10xHis, anu dipotong ku protéase HRC-3C (PPX), anu ngamungkinkeun mandiriéksprésiPrimer anu dianggo pikeun ngaklon Nanchung sareng Inactive kana véktor pBacMam nyaéta sapertos kieu:
Gambar mikroskopis partikel individu diala dina mikroskop éléktron transmisi Titan Krios G2 (FEI) anu dilengkepan kaméra K3 sareng filter énergi Gatan BioQuantum. Mikroskop dioperasikeun dina 300 keV, kalayan setélan énergi 20 eV, ukuran piksel sampel 1,08 Å/piksel (pembesaran nominal 81.000x), sareng gradien defokus ti mimiti -0,8 dugi ka -2,2 μm. Rekaman pidéo dilakukeun dina 40 pigura per detik nganggo mikroskop Latitude S (Gatan) kalayan laju dosis nominal 25 e–px−1 s−1, waktos paparan 2,4 detik, sareng total dosis sakitar 60 e–Å−2.
Koreksi gerakan anu diinduksi ku sinar sareng pembobotan dosis dilakukeun dina pilem nganggo MotionCor2 dina RELION 4.061. Estimasi parameter fungsi transfer kontras (CTF) dilakukeun dina cryoSPARC nganggo metode estimasi CTF berbasis patch62. Fotomikrograf kalayan résolusi pas CTF ≥4 Å dikaluarkeun tina analisis salajengna. Biasana, subset 500–1000 fotomikrograf dianggo pikeun pamilihan titik dina cryoSPARC, dituturkeun ku sababaraha puteran klasifikasi 2D saatos nyaring pikeun kéngingkeun gambar rujukan anu jelas pikeun pamilihan partikel berbasis témplat. Partikel teras diekstrak nganggo kotak wates 64-piksel sareng binning 4-fold. Sababaraha puteran klasifikasi 2D dilakukeun pikeun miceun kategori partikel anu teu dihoyongkeun. Modél 3D awal direkonstruksi nganggo rekonstruksi ab initio sareng disaring nganggo panyempurnaan anu teu seragam dina cryoSPARC. Klasifikasi 3D dilakukeun dina cryoSPARC atanapi RELION dumasar kana heterogenitas ARD. Teu aya heterogenitas anu signifikan tina domain mémbran anu dititénan. Partikel-partikelna dimurnikeun nganggo metode C1 sareng C2; partikel anu gaduh résolusi C2 anu langkung luhur dianggap simétris dibandingkeun sareng C2 sareng diimpor kana RELION pikeun pamurnian Bayesian. Partikel-partikel éta teras dipindahkeun deui ka cryoSPARC pikeun pamurnian lokal sareng henteu seragam. Résolusi ahir sareng jumlah partikel dipidangkeun dina Tabel 1.
Nalika ngolah pentamer Nan+AP, kami nalungtik rupa-rupa metode pikeun ningkatkeun résolusi domain mémbran (utamina daérah pori), sapertos pangurangan sinyal sareng masking TMD. Nanging, usaha ieu henteu suksés kusabab gangguan anu berpotensi ekstrim dina daérah pori sareng heterogenitas TMD sacara umum. Résolusi ahir diitung nganggo masker anu dihasilkeun sacara otomatis ku metode pamrosésan anu henteu seragam dina cryoSPARC, utamina narékahan daérah ARD. Ieu ngahontal résolusi anu langkung luhur tibatan domain mémbran (utamina daérah VSLD).
Modél de novo awal tina bentuk apo tina bug Nanchung sareng Inactive mimitina dihasilkeun nganggo Coot63, sareng modél bug Nan sareng Iav dihasilkeun nganggo AlphaFold264 pikeun ngaidentipikasi daérah anu kurang percaya diri. Pemodelan Calmodulin dumasar kana kacocokan awak kaku tina modél Ca2+-binding sareng Ca2+-free dina aksési PDB 4JPZ56 sareng 1CFD65, masing-masing. Modél-modél éta disampurnakeun nganggo panyempurnaan sferis pikeun mastikeun stéréokimia anu leres sareng géométri anu saé. Fosfatidilkolin, fosfatidilétanolamin, sareng fosfatidilserin teras dimodelkeun salaku kapadetan lipid anu ditetepkeun kalayan saé, sareng ligan NAM sareng AP disimpen dina kapadetan anu saluyu dina tight junction. File kendala dihasilkeun tina senar SMILES tina isoform nganggo eLBOW dina PHENIX66. Pamungkas, modél-modél éta disampurnakeun dina rohangan nyata dina PHENIX nganggo pamilarian grid lokal sareng minimisasi global kalayan kendala struktur sekundér. Server MolProbity dianggo pikeun panyampurnaan modél sareng analisis struktural, sareng ilustrasi dilakukeun nganggo PyMOL sareng UCSF Chimera X. 67,68,69 Analisis apertur dilakukeun nganggo server HOLE,70 sareng pemetaan konservasi runtuyan dilakukeun nganggo server Consurf.71
Analisis statistik dilakukeun nganggo Igor Pro 6.2, Excel Office 365, sareng GraphPad Prism 7.0. Sadaya data kuantitatif dipidangkeun salaku rata-rata ± kasalahan standar (SEM). Uji-t Student (dua sisi, teu dipasangkeun) dianggo pikeun ngabandingkeun dua kelompok. Analisis varian hiji arah (ANOVA) dituturkeun ku uji post hoc Dunnett dianggo pikeun ngabandingkeun sababaraha kelompok. *P< 0.05, **P< 0.01, sareng ***P< 0,001 dianggap signifikan sacara statistik gumantung kana distribusi data. Nilai Kd, Ki, sareng interval kapercayaan 95% asimetrisna diitung nganggo GraphPad Prism 10.
Kanggo langkung seueur rinci ngeunaan metodologi panilitian, mangga tingali Ringkesan Laporan Portofolio Alam anu ditautan dina tulisan ieu.
Modél awal diwangun nganggo modél calmodulin tina database PDB 4JPZ sareng 1CFD. Koordinatna parantos disimpen dina Bank Data Protéin (PDB) dina nomer aksési 9NVN (Nan-Iav-CaM tanpa ligan), 9NVO (Nan-Iav-CaM kabeungkeut kana nikotinamida), 9NVP (Nan-Iav-CaM kabeungkeut kana nikotinamida sareng EDTA), 9NVQ (Nan-Iav-CaM kabeungkeut kana aphenidolpyrrolline sareng kalsium), 9NVR (Nan-Iav-CaM kabeungkeut kana aphenidolpyrrolline sareng EDTA), sareng 9NVS (Nan pentamer kabeungkeut kana aphenidolpyrrolline). Gambar mikroskop krio-éléktron anu saluyu disimpen dina Database Mikroskop Éléktron (EMDB) dina nomer aksési ieu: EMD-49844 (Nan-Iav-CaM tanpa ligan), EMD-49845 (kompleks Nan-Iav-CaM sareng nikotinamida), EMD-49846 (kompleks Nan-Iav-CaM sareng nikotinamida sareng EDTA), EMD-49847 (kompleks Nan-Iav-CaM sareng afidopirolina sareng kalsium), EMD-49848 (kompleks Nan-Iav-CaM sareng afidopirolina sareng EDTA), sareng EMD-49849 (kompleks Nan pentamer sareng afidopirolina). Data atah pikeun analisis fungsional dipidangkeun dina tulisan ieu.
Waktos posting: 28 Januari 2026