Obat anthelmintik N,N-diethyl-m-toluamide (DEET) geus dilaporkeun ngahambat AChE (acetylcholinesterase) jeung boga sipat karsinogenik poténsi alatan vascularization kaleuleuwihan. Dina makalah ieu, kami nunjukkeun yén DEET sacara khusus ngarangsang sél endothelial anu ngamajukeun angiogenesis, ku kituna ningkatkeun pertumbuhan tumor. DEET ngaktifkeun prosés sélular ngarah kana angiogenesis, kalebet proliferasi, migrasi, sareng adhesion. Ieu pakait sareng ngaronjat produksi NO jeung éksprési VEGF dina sél endothelial. Silencing M3 atanapi nganggo sambetan M3 farmakologis ngaleungitkeun sadaya épék ieu, nunjukkeun yén angiogenesis anu diinduksi DEET sénsitip M3. Percobaan ngalibetkeun kalsium signalling dina sél endothelial na HEK overexpressing reséptor M3, kitu ogé ngariung jeung docking studi, nunjukkeun yén DEET meta salaku hiji modulator allosteric reséptor M3. Saterusna, DEET ngahambat AChE, kukituna ngaronjatkeun bioavailability of acetylcholine sarta ngariung ka reséptor M3, sarta enhancing épék proangiogenic ngaliwatan régulasi allosteric.
EC primér diisolasi tina aorta beurit Swiss. Métode ékstraksi diadaptasi tina protokol Kobayashi 26 . Murine ECs dibudidayakan dina medium EBM-2 ditambah ku 5% FBS anu teu aktif panas dugi ka petikan kaopat.
Pangaruh dua konsentrasi DEET dina proliferasi HUVEC, U87MG, atanapi BF16F10 dianalisis nganggo CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026). Sakeudeung, 5,103 sél per sumur dibibita dina piring 96-sumur, diidinan ngagantelkeun sapeuting, teras dirawat kalayan DEET salami 24 jam. Saatos miceun médium pertumbuhan, tambahkeun larutan pengikat pewarna ka unggal sumur mikroplate sareng inkubasi sél dina suhu 37 ° C salami 30 menit. Tingkat fluoresensi ditangtukeun nganggo pamaca microplate multimode Mithras LB940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Jérman) dilengkepan saringan éksitasi 485 nm sareng saringan émisi 530 nm.
HUVEC dibibitkeun dina pelat sumur 96 kalayan kapadetan 104 sél per sumur. Sél dirawat kalayan DEET salami 24 jam. Viability sél ditaksir nganggo assay MTT colorimetric (Sigma-Aldrich, M5655). Nilai dénsitas optik dicandak dina pamaca microplate multimode (Mithras LB940) dina panjang gelombang 570 nm.
Balukar DEET diulik nganggo in vitro angiogenesis assays. Perlakuan jeung 10-8 M atawa 10-5 M DEET ngaronjat formasi panjang kapilér di HUVECs (Gbr. 1a, b, bar bodas). Dibandingkeun sareng kelompok kontrol, perlakuan sareng konsentrasi DEET mimitian ti 10-14 dugi ka 10-5 M nunjukkeun yén panjang kapilér ngahontal dataran tinggi dina 10-8 M DEET (Suplemén Gbr. S2). Teu aya bédana anu signifikan dina pangaruh proangiogenik in vitro HUVEC anu dirawat kalayan DEET dina kisaran konsentrasi 10-8 M sareng 10-5 M.
Pikeun nangtoskeun pangaruh DEET dina neovascularization, kami ngalaksanakeun studi neovascularization in vivo. Sanggeus 14 poé, mencit nyuntik sél endothelial precultured kalawan 10-8 M atawa 10-5 M DEET némbongkeun paningkatan signifikan dina eusi hémoglobin (Gbr. 1c, bar bodas).
Saterusna, neovascularization DEET-ngainduksi ieu diulik dina U87MG beurit xenograft-bearing nu nyuntik poean (ip) kalawan DEET dina dosis dipikawanoh pikeun ngainduksi konsentrasi plasma tina 10-5 M, nu normal dina manusa kakeunaan. dina 23. Tumor bisa dideteksi (ie tumor> 100 mm3) anu observasi 14 poé sanggeus suntik sél U87MG kana mencit. Dina dinten 28, pertumbuhan tumor sacara signifikan ningkat dina beurit anu dirawat DEET dibandingkeun sareng beurit kontrol (Gbr. 1d, kuadrat). Salajengna, ngawarnaan CD31 tumor nunjukkeun yén DEET sacara signifikan ningkatkeun daérah kapilér tapi henteu dénsitas microvessel. (Gbr. 1e–g).
Pikeun nangtukeun peran reséptor muscarinic dina proliferasi DETA-ngainduksi, 10-8 M atanapi 10-5 M DETA ku ayana pFHHSiD (10-7 M, hiji antagonis reséptor M3 selektif) dipaké. Perlakuan HUVEC. pFHHSiD lengkep ngablokir sipat proliferatif DETA dina sadaya konsentrasi (Tabel 1).
Dina kaayaan ieu, urang ogé nalungtik naha DEET bakal ningkatkeun panjang kapilér dina sél HUVEC. Nya kitu, pFHHSiD nyata nyegah DEET-ngainduksi panjang kapilér (Gbr. 1a, b, abu bar). Saterusna, percobaan sarupa dipigawé kalawan M3 siRNA. Sanajan kontrol siRNA teu éféktif dina ngamajukeun formasi kapilér, silencing tina reséptor muscarinic M3 dileungitkeun kamampuh DEET nambahan panjang kapilér (Gbr. 1a, b, bar hideung).
Saterusna, duanana 10-8 M atanapi 10-5 M DEET-ngainduksi vascularization in vitro na neovascularization in vivo sagemblengna diblokir ku pFHHSiD (Gbr. 1c, d, bunderan). Hasil ieu nunjukkeun yén DEET ngamajukeun angiogenesis ngaliwatan jalur anu sénsitip kana antagonis reséptor M3 selektif atanapi siRNA M3.
AChE nyaéta target molekular DEET. Ubar sapertos donepezil, anu bertindak salaku inhibitor AChE, tiasa merangsang EC angiogenesis in vitro sareng dina model iskemia hindlimb beurit14. Kami nguji pangaruh dua konsentrasi DEET dina kagiatan énzim AChE dina HUVEC. Low (10-8 M) jeung luhur (10-5 M) konsentrasi DEET turun aktivitas AChE endothelial dibandingkeun kaayaan kontrol (Gbr. 2).
Duanana konsentrasi DEET (10-8 M jeung 10-5 M) ngurangan aktivitas acetylcholinesterase on HUVEC. BW284c51 (10-5 M) dipaké salaku kontrol pikeun sambetan acetylcholinesterase. Hasilna dinyatakeun salaku perséntase kagiatan AChE dina HUVEC anu dirawat ku dua konsentrasi DEET dibandingkeun sareng sél anu dirawat kandaraan. Nilai dinyatakeun salaku mean ± SEM tina genep percobaan bebas. *p <0.05 dibandingkeun kontrol (Kruskal-Wallis na Dunn sababaraha tés ngabandingkeun).
Nitrat oksida (NO) aub dina prosés angiogenic 33, kituna, NO produksi di DEET-dirangsang HUVECs ieu diajarkeun. DEET-diperlakukeun produksi NO endothelial ngaronjat dibandingkeun sél kontrol, tapi ngahontal significance ukur dina dosis 10-8 M (Gbr. 3c). Pikeun nangtukeun parobahan molekular ngadalikeun produksi NO DEET-ngainduksi, ekspresi eNOS jeung aktivasina dianalisis ku Western blotting. Sanaos perlakuan DEET henteu ngarobih ekspresi eNOS, éta sacara signifikan ningkatkeun fosforilasi eNOS dina situs aktivasina (Ser-1177) bari ngirangan situs ngahambatna (Thr-495) dibandingkeun sareng sél anu teu dirawat dina fosforilasi eNOS (Gbr. 3d). Saterusna, babandingan eNOS phosphorylated di situs aktivasina jeung situs inhibitory diitung sanggeus normalizing jumlah eNOS phosphorylated kana jumlah total énzim. Rasio ieu ngaronjat sacara signifikan dina HUVECs diperlakukeun kalayan tiap konsentrasi DEET dibandingkeun sél untreated (Gbr. 3d).
Tungtungna, ekspresi VEGF, salah sahiji faktor proangiogenic utama, dianalisis ku Western blotting. DEET sacara signifikan ningkatkeun éksprési VEGF, sedengkeun pFHHSiD lengkep ngablokir éksprési ieu.
Kusabab épék DEET sénsitip kana blokade farmakologis sareng régulasi reséptor M3, kami nguji hipotésis yén DEET tiasa ningkatkeun sinyal kalsium. Ahéng, DEET gagal pikeun ngaronjatkeun kalsium cytoplasmic di HUVEC (data teu ditémbongkeun) jeung HEK / M3 (Gbr. 4a, b) pikeun duanana konsentrasi dipaké.
waktos pos: Dec-30-2024