Obat anthelmintik N,N-diethyl-m-toluamide (DEET) parantos dilaporkeun ngahambat AChE (asetilkolinesterase) sareng gaduh sipat karsinogenik poténsial kusabab vaskularisasi anu kaleuleuwihi. Dina tulisan ieu, urang nunjukkeun yén DEET khusus ngarangsang sél endotel anu ngamajukeun angiogenesis, sahingga ningkatkeun kamekaran tumor. DEET ngaktipkeun prosés sélular anu ngarah kana angiogenesis, kalebet proliferasi, migrasi, sareng adhesi. Ieu aya hubunganana sareng ningkatna produksi NO sareng éksprési VEGF dina sél endotel. Ngareureuhkeun M3 atanapi nganggo inhibitor M3 farmakologis ngaleungitkeun sadaya épék ieu, nunjukkeun yén angiogenesis anu diinduksi DEET sénsitip kana M3. Ékspérimén anu ngalibatkeun sinyal kalsium dina sél endotel sareng HEK anu ngébréhkeun reséptor M3, ogé studi ngabeungkeut sareng docking, nunjukkeun yén DEET bertindak salaku modulator alosterik reséptor M3. Salajengna, DEET ngahambat AChE, sahingga ningkatkeun bioavailabilitas asetilkolin sareng ngabeungkeutna kana reséptor M3, sareng ningkatkeun épék proangiogenik ngalangkungan régulasi alosterik.
EC primér diisolasi tina aorta beurit Swiss. Métode ékstraksi diadaptasi tina protokol Kobayashi 26. EC Murine dibudidayakeun dina média EBM-2 anu ditambahan ku 5% FBS anu diinaktivasi ku panas dugi ka petikan kaopat.
Pangaruh dua konsentrasi DEET kana proliferasi HUVEC, U87MG, atanapi BF16F10 dianalisis nganggo CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026). Sacara singget, 5,103 sél per sumur disiram dina pelat 96-sumur, diantepkeun sapeuting, teras dirawat ku DEET salami 24 jam. Saatos miceun média kamekaran, tambahkeun larutan pangiket pewarna kana unggal sumur pelat mikro sareng inkubasi sél dina suhu 37 °C salami 30 menit. Tingkat fluoresensi ditangtukeun nganggo pembaca pelat mikro multimode Mithras LB940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Jerman) anu dilengkepan ku filter eksitasi 485 nm sareng filter émisi 530 nm.
HUVEC diubur dina pelat 96-sumur kalayan kapadetan 104 sél per sumur. Sél dirawat ku DEET salami 24 jam. Viabilitas sél ditaksir nganggo uji MTT kolorimetri (Sigma-Aldrich, M5655). Nilai kapadetan optik diala dina pamaca pelat mikro multimode (Mithras LB940) dina panjang gelombang 570 nm.
Pangaruh DEET diulik nganggo uji angiogenesis in vitro. Perawatan nganggo 10-8 M atanapi 10-5 M DEET ningkatkeun formasi panjang kapiler dina HUVEC (Gambar 1a, b, garis bodas). Dibandingkeun sareng kelompok kontrol, perawatan nganggo konsentrasi DEET ti 10-14 dugi ka 10-5 M nunjukkeun yén panjang kapiler ngahontal dataran tinggi dina 10-8 M DEET (Gambar Tambahan S2). Teu aya bédana anu signifikan anu kapendak dina pangaruh proangiogenik in vitro HUVEC anu dirawat nganggo DEET dina kisaran konsentrasi 10-8 M sareng 10-5 M.
Pikeun nangtukeun pangaruh DEET kana neovaskularisasi, urang ngalaksanakeun studi neovaskularisasi in vivo. Saatos 14 dinten, beurit anu disuntik sél endotel anu dikultur sateuacanna ku 10-8 M atanapi 10-5 M DEET nunjukkeun paningkatan anu signifikan dina eusi hemoglobin (Gambar 1c, garis bodas).
Salajengna, neovaskularisasi anu diinduksi DEET ditalungtik dina beurit anu ngandung xenograft U87MG anu disuntik unggal dinten (ip) ku DEET dina dosis anu dipikanyaho pikeun ngainduksi konsentrasi plasma 10-5 M, anu normal dina manusa anu kakeunaan. dina 23. Tumor anu tiasa dideteksi (nyaéta tumor >100 mm3) dititénan 14 dinten saatos suntikan sél U87MG kana beurit. Dina dinten ka-28, kamekaran tumor ningkat sacara signifikan dina beurit anu dirawat DEET dibandingkeun sareng beurit kontrol (Gambar 1d, kotak). Salajengna, pewarnaan CD31 tumor nunjukkeun yén DEET sacara signifikan ningkatkeun daérah kapiler tapi sanés kapadetan mikrovaskular. (Gambar 1e–g).
Pikeun nangtukeun peran reséptor muskarinik dina proliferasi anu diinduksi DETA, 10-8 M atanapi 10-5 M DETA kalayan ayana pFHHSiD (10-7 M, antagonis reséptor M3 selektif) dianggo. Perawatan HUVEC. pFHHSiD ngahalangan sacara lengkep sipat proliferatif DETA dina sadaya konsentrasi (Tabel 1).
Dina kaayaan ieu, urang ogé nalungtik naha DEET bakal ningkatkeun panjang kapiler dina sél HUVEC. Sarua kitu, pFHHSiD sacara signifikan nyegah panjang kapiler anu diinduksi DEET (Gambar 1a, b, batang kulawu). Salajengna, ékspérimén anu sami dilakukeun sareng siRNA M3. Sanaos siRNA kontrol henteu efektif dina ngamajukeun formasi kapiler, ngareureuhkeun reséptor muskarinik M3 ngaleungitkeun kamampuan DEET pikeun ningkatkeun panjang kapiler (Gambar 1a, b, batang hideung).
Salajengna, vaskularisasi in vitro sareng neovaskularisasi in vivo anu diinduksi ku 10-8 M atanapi 10-5 M DEET diblokir sapinuhna ku pFHHSiD (Gambar 1c, d, bunderan). Hasil ieu nunjukkeun yén DEET ngamajukeun angiogenesis ngaliwatan jalur anu sénsitip kana antagonis reséptor M3 selektif atanapi siRNA M3.
AChE nyaéta target molekuler DEET. Obat-obatan sapertos donepezil, anu bertindak salaku inhibitor AChE, tiasa ngarangsang angiogenesis EC in vitro sareng dina modél iskemia hindlimb beurit14. Kami nguji pangaruh dua konsentrasi DEET kana aktivitas énzim AChE dina HUVEC. Konsentrasi DEET anu handap (10-8 M) sareng luhur (10-5 M) ngirangan aktivitas AChE endotel dibandingkeun sareng kaayaan kontrol (Gambar 2).
Duanana konsentrasi DEET (10-8 M sareng 10-5 M) ngirangan aktivitas asetilkolinesterase dina HUVEC. BW284c51 (10-5 M) dianggo salaku kontrol pikeun inhibitor asetilkolinesterase. Hasilna dinyatakeun salaku persentase aktivitas AChE dina HUVEC anu dirawat ku dua konsentrasi DEET dibandingkeun sareng sél anu dirawat ku kendaraan. Nilai dinyatakeun salaku rata-rata ± SEM tina genep ékspérimén mandiri. *p < 0,05 dibandingkeun sareng kontrol (uji babandingan ganda Kruskal-Wallis sareng Dunn).
Nitrat oksida (NO) kalibet dina prosés angiogenik 33, ku kituna, produksi NO dina HUVEC anu distimulasi DEET ditalungtik. Produksi NO endotel anu dirawat DEET ningkat dibandingkeun sareng sél kontrol, tapi ngan ukur ngahontal signifikansi dina dosis 10-8 M (Gambar 3c). Pikeun nangtukeun parobahan molekuler anu ngontrol produksi NO anu diinduksi DEET, éksprési sareng aktivasi eNOS dianalisis ku Western blotting. Sanaos pangobatan DEET henteu ngarobih éksprési eNOS, éta ningkatkeun fosforilasi eNOS sacara signifikan dina situs aktivasina (Ser-1177) bari ngirangan situs inhibisi (Thr-495) dibandingkeun sareng sél anu henteu dirawat dina fosforilasi eNOS (Gambar 3d). Salajengna, babandingan eNOS anu terfosforilasi dina situs aktivasi sareng situs inhibisi diitung saatos normalisasi jumlah eNOS anu terfosforilasi kana jumlah total énzim. Babandingan ieu ningkat sacara signifikan dina HUVEC anu dirawat ku unggal konsentrasi DEET dibandingkeun sareng sél anu henteu dirawat (Gambar 3d).
Pamungkas, éksprési VEGF, salah sahiji faktor proangiogenik utama, dianalisis ku Western blotting. DEET ningkatkeun éksprési VEGF sacara signifikan, sedengkeun pFHHSiD ngahalangan éksprési ieu sacara lengkep.
Kusabab pangaruh DEET sénsitip kana blokade farmakologis sareng downregulation reséptor M3, kami nguji hipotesis yén DEET tiasa ningkatkeun sinyal kalsium. Anu anéh, DEET gagal ningkatkeun kalsium sitoplasma dina HUVEC (data henteu dipidangkeun) sareng HEK/M3 (Gambar 4a, b) pikeun duanana konsentrasi anu dianggo.
Waktos posting: 30 Désémber 2024