Tumuwuh meristem apikal (SAM) némbak penting pikeun arsitéktur batang. Hormon tutuwuhangiberelin(GAs) maénkeun peran konci dina koordinasi tumuwuhna tutuwuhan, tapi peran maranéhanana dina SAM tetep kirang dipikaharti. Di dieu, urang ngembangkeun hiji biosensor ratiometric tina signalling GA ku rékayasa protéin DELLA pikeun ngurangan fungsi pangaturan penting na dina respon transcriptional GA bari preserving degradasi na kana pangakuan GA. Kami nunjukkeun yén biosensor dumasar-degradasi ieu sacara akurat ngarékam parobahan dina tingkat GA sareng sensing sélular nalika pangwangunan. Kami nganggo biosensor ieu pikeun peta kagiatan sinyal ga dina SAM. Kami nunjukkeun yén sinyal GA tinggi biasana aya dina sél anu aya di antara primordia organ, anu mangrupikeun prékursor sél internode. Ngagunakeun pendekatan gain- jeung leungitna-of-fungsi, urang salajengna demonstrate yén GA ngatur orientasi pesawat division sél, ngadegkeun organisasi sélular canonical of internodes, kukituna promosi spésifikasi internode dina SAM.
Pucuk apical meristem (SAM), ayana di pucuk pucuk, ngandung niche sél stém anu aktivitas ngahasilkeun organ gurat jeung titik batang dina cara modular sarta iterative sapanjang hirup tutuwuhan. Masing-masing unit pengulangan, atanapi titik tutuwuhan, kalebet internodes sareng organ gurat dina titik, sareng meristem aksila dina ketiak daun1. Tumuwuh sareng organisasi titik tutuwuhan robih salami pangwangunan. Dina Arabidopsis, pertumbuhan internodal diteken nalika tahap vegetatif, sareng meristem axillary tetep dormant dina axils daun rosette. Dina mangsa transisi ka fase kembangan, SAM jadi inflorescence meristem, ngahasilkeun internodes elongated jeung kuncup axillary, branchlets dina axils daun cauline, sarta saterusna, kembang tanpa daun2. Sanajan urang geus nyieun kamajuan signifikan dina pamahaman mékanisme nu ngadalikeun inisiasi daun, kembang, jeung dahan, rélatif saeutik anu dipikawanoh ngeunaan kumaha internodes timbul.
Ngartos distribusi spatiotemporal GA bakal ngabantosan langkung ngartos fungsi hormon ieu dina jaringan anu béda sareng dina tahap pangembangan anu béda. Visualisasi tina degradasi fusi RGA-GFP dinyatakeun dina aksi promoter sorangan nyadiakeun informasi penting dina pangaturan tingkat total ga di roots15,16. Tapi, ekspresi RGA beda-beda dina jaringan17 sareng diatur ku GA18. Ku kituna, éksprési diferensial tina promoter RGA bisa ngakibatkeun pola fluoresensi observasi kalawan RGA-GFP sahingga metoda ieu teu kuantitatif. Nu leuwih anyar, bioactive fluorescein (Fl) -labeled GA19,20 ngungkabkeun akumulasi GA dina endocortex akar jeung pangaturan tingkat sélular na ku angkutan GA. Anyar-anyar ieu, sensor GA FRET nlsGPS1 nunjukkeun yén tingkat GA pakait sareng pemanjangan sél dina akar, filamén, sareng hypocotyls21 anu poék. Sanajan kitu, sakumaha geus urang katempo, konsentrasi GA teu hijina parameter ngadalikeun aktivitas signalling ga, sabab gumantung kana prosés sensing kompléks. Di dieu, dumasar kana pamahaman kami ngeunaan jalur sinyal DELLA sareng GA, kami ngalaporkeun pamekaran sareng karakterisasi biosensor ratiometric dumasar-degradasi pikeun sinyal GA. Pikeun ngembangkeun biosensor kuantitatif ieu, kami nganggo RGA sénsitip GA mutant anu dihijikeun kana protéin fluoresensi sareng diumumkeun di mana-mana dina jaringan, ogé protéin fluoresensi anu teu peka GA. Kami nunjukkeun yén fusions protéin RGA mutant henteu ngaganggu sinyal GA endogenous nalika dinyatakeun di mana-mana, sareng yén biosensor ieu tiasa ngitung kagiatan sinyal hasil tina input GA sareng pamrosésan sinyal GA ku aparat sensing kalayan resolusi spatiotemporal anu luhur. Kami nganggo biosensor ieu pikeun peta sebaran spatiotemporal kagiatan signalling GA sareng ngitung kumaha GA ngatur paripolah sélular dina épidermis SAM. Kami nunjukkeun yén GA ngatur orientasi bidang pamisahan sél SAM anu aya di antara primordia organ, ku kituna netepkeun organisasi sélular kanonik internode.
Tungtungna, urang naroskeun naha qmRGA tiasa ngalaporkeun parobahan tingkat ga endogenous ngagunakeun hypocotyls tumuwuh. Urang saméméhna némbongkeun yén nitrat ngarangsang tumuwuhna ku ngaronjatna sintésis GA jeung, kahareupna degradasi DELLA34. Sasuai, urang katalungtik yén panjang hypocotyl dina bibit pUBQ10 :: qmRGA tumuwuh dina suplai nitrat loba pisan (10 mM NO3−) nyata leuwih panjang batan nu di bibit tumuwuh dina kaayaan kakurangan nitrat (Suplemén Gbr. 6a). Konsisten jeung réspon pertumbuhan, sinyal GA leuwih luhur dina hypocotyls bibit tumuwuh dina kaayaan 10 mM NO3− ti dina bibit tumuwuh dina henteuna nitrat (Suplemén Gbr. 6b, c). Ku kituna, qmRGA ogé ngamungkinkeun ngawas parobahan dina signalling GA ngainduksi ku parobahan endogenous dina konsentrasi GA.
Pikeun ngartos naha kagiatan signalling ga anu dideteksi ku qmRGA gumantung kana konsentrasi ga sareng persepsi ga, sakumaha anu diharapkeun dumasar kana desain sensor, kami nganalisis ekspresi tilu reséptor GID1 dina jaringan vegetatif sareng réproduktif. Dina bibit, garis reporter GID1-GUS némbongkeun yén GID1a jeung c anu kacida dinyatakeun dina cotyledons (Gbr. 3a-c). Sajaba ti éta, tilu reséptor dinyatakeun dina daun, primordia akar gurat, tip akar (iwal cap akar GID1b), sarta sistem vaskular (Gbr. 3a-c). Dina inflorescence SAM, urang ngadeteksi sinyal GUS ngan pikeun GID1b sareng 1c (Suplemén Gbr. 7a-c). Hibridisasi in situ dikonfirmasi pola ekspresi ieu sarta salajengna nunjukkeun yén GID1c ieu seragam dikedalkeun dina tingkat low di SAM, sedengkeun GID1b némbongkeun ekspresi luhur di periphery tina SAM (Suplemén Gbr. 7d-l). The pGID1b:: 2xmTQ2-GID1b translasi fusi ogé ngungkabkeun rentang gradasi éksprési GID1b, ti handap atawa euweuh éksprési di puseur SAM mun ekspresi tinggi di wates organ (Suplemén Gbr. 7m). Ku kituna, reséptor GID1 henteu disebarkeun saragam di sakuliah sareng dina jaringan. Dina percobaan saterusna, urang ogé katalungtik yén overexpression of GID1 (pUBQ10 :: GID1a-mCherry) ngaronjat sensitipitas qmRGA di hypocotyls kana aplikasi ga éksternal (Gbr. 3d, e). Kontras, fluoresensi diukur ku qd17mRGA dina hypocotyl éta merhatikeun perlakuan GA3 (Gbr. 3f, g). Pikeun duanana assays, bibit dirawat kalayan konsentrasi luhur GA (100 μM GA3) pikeun assess paripolah gancang tina sensor, dimana kamampuhan pikeun ngabeungkeut reséptor GID1 ieu ditingkatkeun atawa leungit. Kalawan babarengan, hasil ieu mastikeun yén biosensor qmRGA ngagaduhan fungsi gabungan salaku sensor ga sareng ga, sareng nunjukkeun yén éksprési diferensial tina reséptor GID1 tiasa sacara signifikan modulasi émisi sénsor.
Nepi ka ayeuna, distribusi sinyal GA dina SAM tetep teu jelas. Kituna, urang dipaké qmRGA-ekspresi tutuwuhan jeung pCLV3 :: mCherry-NLS sél sirung reporter35 keur ngitung resolusi luhur peta kuantitatif aktivitas signalling ga, fokus dina lapisan L1 (épidermis; Gbr. 4a, b, tingali Métode jeung Métode tambahan), saprak L1 muterkeun hiji peran konci dina ngadalikeun growth36 SAM. Di dieu, pCLV3::mCherry-NLS éksprési nyadiakeun titik rujukan geometri tetep keur analisa sebaran spatiotemporal ga signalling activity37. Sanajan GA dianggap penting pisan pikeun development4 organ gurat, urang katalungtik yén sinyal GA éta low dina primordium floral (P) mimitian ti tahap P3 (Gbr. 4a, b), sedengkeun primordiums ngora P1 na P2 miboga aktivitas sedeng sarupa nu di wewengkon sentral (Gbr. 4a, b). Kagiatan signalling GA nu leuwih luhur dideteksi dina wates primordium organ, dimimitian dina P1 / P2 (di sisi wates) jeung peaking di P4, kitu ogé dina sakabéh sél wewengkon periferal lokasina antara primordia (Gbr. 4a, b jeung Suplemén Gbr. 8a, b). Aktivitas signalling GA anu langkung luhur ieu dititénan henteu ngan ukur dina épidermis tapi ogé dina lapisan L2 sareng L3 luhur (Suplemén Gbr. 8b). Pola sinyal GA dideteksi dina SAM maké qmRGA ogé tetep unchanged kana waktu (Suplemén Gbr. 8c-f, k). Sanajan qd17mRGA nyusunna ieu sacara sistematis downregulated dina SAM tutuwuhan T3 tina lima garis bebas nu urang dicirikeun di jéntré, kami bisa nganalisis pola fluoresensi diala ku pRPS5a :: VENUS-2A-TagBFP ngawangun (Suplemén Gbr. 8g-j, l). Dina garis kontrol ieu, ngan ukur parobahan leutik dina rasio fluoresensi anu dideteksi dina SAM, tapi di pusat SAM kami ningali panurunan anu jelas sareng teu kaduga dina VENUS pakait sareng TagBFP. Ieu negeskeun yén pola sinyal anu dititénan ku qmRGA ngagambarkeun degradasi gumantung kana GA-mRGA-VENUS, tapi ogé nunjukkeun yén qmRGA tiasa ngaleuleuskeun kagiatan sinyal GA dina pusat meristem. Kasimpulanana, hasil kami nembongkeun pola sinyal GA anu utamina ngagambarkeun distribusi primordia. Sebaran ieu wewengkon inter-primordial (IPR) téh alatan ngadegna bertahap tina aktivitas signalling GA tinggi antara ngembangkeun primordium jeung wewengkon sentral, bari dina waktos anu sareng aktivitas signalling GA dina primordium nurun (Gbr. 4c, d).
Distribusi reséptor GID1b sareng GID1c (tingali di luhur) nunjukkeun yén éksprési diferensial reséptor GA ngabantosan bentuk pola kagiatan sinyal GA dina SAM. Urang wondered naha akumulasi diferensial GA bisa jadi kalibet. Pikeun nalungtik kamungkinan ieu, kami nganggo nlsGPS1 GA FRET sensor21. Ngaronjat frékuénsi aktivasina dideteksi dina SAM of nlsGPS1 dirawat kalayan 10 μM GA4 + 7 pikeun 100 mnt (Suplemén Gbr. 9a-e), nunjukkeun yén nlsGPS1 ngabales parobahan konsentrasi GA dina SAM, sakumaha dina roots21. Distribusi spasial frékuénsi aktivasina nlsGPS1 ngungkabkeun tingkat GA rélatif low dina lapisan luar SAM, tapi némbongkeun yén maranéhanana elevated di tengah jeung di wates of SAM (Gbr. 4e jeung Gbr. Tambahan. 9a, c). Ieu nunjukkeun yén GA ogé disebarkeun dina SAM kalayan pola spasial anu dibandingkeun sareng anu diungkabkeun ku qmRGA. Salaku pendekatan pelengkap, kami ogé ngarawat SAM sareng fluoresensi GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) atanapi Fl nyalira salaku kontrol négatip. Sinyal Fl disebarkeun sapanjang SAM, kalebet daérah sentral sareng primordium, sanaos dina inténsitas anu langkung handap (Gbr. 4j sareng Gambar Tambahan 10d). Kontras, sakabeh tilu GA-Fl akumulasi husus dina wates primordium jeung ka varying derajat dina sesa IPR, kalawan GA7-Fl accumulating dina domain pangbadagna di IPR (Gbr. 4k jeung Suplemén Gbr. 10a, b). Kuantitas inténsitas fluoresensi ngungkabkeun yén IPR kana rasio inténsitas non-IPR langkung luhur dina GA-Fl-diperlakukeun SAM dibandingkeun Fl-diperlakukeun SAM (Gbr. 4l jeung Suplemén Gbr. 10c). Kalawan babarengan, hasil ieu nunjukkeun yén GA hadir dina konsentrasi luhur dina sél IPR anu lokasina pangdeukeutna ka wates organ. Ieu nunjukkeun yén pola kagiatan sinyal SAM GA hasil tina duanana ekspresi diferensial reséptor GA jeung akumulasi diferensial GA dina sél IPR deukeut wates organ. Ku kituna, analisa kami ngungkabkeun pola spatiotemporal anu teu kaduga tina sinyal GA, kalayan kagiatan anu langkung handap di tengah sareng primordium SAM sareng kagiatan anu langkung luhur dina IPR di daérah periferal.
Pikeun ngartos peran kagiatan sinyal diferensial GA dina SAM, kami nganalisis korelasi antara kagiatan sinyal GA, ékspansi sél, sareng pamisahan sél nganggo pencitraan waktos-selang sacara real-time tina SAM qmRGA pCLV3 :: mCherry-NLS. Dibikeun peran GA dina pangaturan pertumbuhan, korelasi positif sareng parameter ékspansi sél diperkirakeun. Ku alatan éta, urang mimiti ngabandingkeun peta aktivitas signalling GA jeung peta laju tumuwuh permukaan sél (salaku proksi pikeun kakuatan ékspansi sél pikeun sél dibikeun jeung sél putri di division) jeung peta anisotropi tumuwuhna, nu ngukur directionality ékspansi sél (ogé dipaké di dieu pikeun sél dibikeun jeung sél putri di division; Gbr. 5a, b, tingali Métode jeung Métode Suplemén). Peta kami ngeunaan laju pertumbuhan permukaan sél SAM konsisten sareng observasi saméméhna38,39, kalayan tingkat pertumbuhan minimal dina wates sareng tingkat pertumbuhan maksimal dina ngembang kembang (Gbr. 5a). Analisis komponén poko (PCA) némbongkeun yén kagiatan signalling GA ieu négatip correlated kalawan inténsitas pertumbuhan beungeut sél (Gambar 5c). Kami ogé nunjukkeun yén sumbu utama variasi, kalebet input sinyal GA sareng inténsitas kamekaran, ortogonal kana arah anu ditangtukeun ku éksprési CLV3 anu luhur, mastikeun pangaluaran sél tina pusat SAM dina sésa analisa. Analisis korelasi Spearman negeskeun hasil PCA (Gambar 5d), nunjukkeun yén sinyal GA anu langkung luhur dina IPR henteu nyababkeun ékspansi sél anu langkung luhur. Nanging, analisis korelasi ngungkabkeun korelasi anu rada positip antara kagiatan signalling GA sareng anisotropi pertumbuhan (Gambar 5c, d), nunjukkeun yén sinyal GA anu langkung luhur dina IPR mangaruhan arah pertumbuhan sél sareng kamungkinan posisi pesawat division sél.
a, b Peta panas tumuwuhna permukaan rata (a) sarta anisotropi pertumbuhan (b) dina SAM averaged leuwih tujuh tutuwuhan bebas (dipaké salaku proxy pikeun kakuatan jeung arah ékspansi sél, mungguh). c analisis PCA kaasup variabel handap: sinyal GA, inténsitas tumuwuhna permukaan, anisotropi pertumbuhan permukaan, sarta éksprési CLV3. Komponén PCA 1 ieu utamana négatip correlated kalawan inténsitas pertumbuhan permukaan jeung positif correlated kalawan sinyal GA. Komponén PCA 2 ieu utamana positif correlated kalawan anisotropi tumuwuhna permukaan jeung négatip correlated kalawan éksprési CLV3. Persentase ngagambarkeun variasi anu dipedar ku unggal komponén. d Analisis korelasi Spearman antara sinyal GA, inténsitas pertumbuhan permukaan, sarta anisotropi pertumbuhan permukaan dina skala jaringan kaasup CZ. Jumlah di katuhu nyaéta Spearman rho nilai antara dua variabel. Tanda bintang nunjukkeun kasus dimana korelasi / korelasi négatip kacida signifikan. e visualisasi 3D sél Col-0 SAM L1 ku mikroskop confocal. Tembok sél anyar anu kabentuk dina SAM (tapi sanés primordium) dina jam 10 diwarnaan dumasar kana nilai sudutna. Bar warna dipidangkeun di pojok katuhu handap. Inset nembongkeun gambar 3D pakait dina 0 h. Percobaan diulang dua kali kalayan hasil anu sami. f Box plot mintonkeun laju division sél dina IPR jeung non-IPR Col-0 SAM (n = 10 tutuwuhan mandiri). Garis tengah nunjukkeun median, sareng wates kotak nunjukkeun persentil ka-25 sareng ka-75. Kumis nunjukkeun nilai minimum sareng maksimum anu ditangtukeun ku parangkat lunak Sunda. Nilai P dicandak ku t-test dua buntut Welch. g, h diagram Schematic némbongkeun (g) kumaha carana ngukur sudut témbok sél anyar (magénta) nu aya kaitannana ka arah radial ti puseur SAM (garis dotted bodas) (ngan nilai sudut akut, ie, 0-90 °, dianggap), sarta (h) arah circumferential / gurat jeung radial dina meristem. i Frekuensi histograms orientasi pesawat division sél peuntas SAM (biru poék), IPR (biru sedeng), sarta non-IPR (biru lampu), masing-masing. Nilai P dicandak ku uji Kolmogorov-Smirnov dua-buntut. Percobaan diulang dua kali kalayan hasil anu sami. j Frékuénsi histograms orientasi pesawat division sél tina IPR sabudeureun P3 (héjo lampu), P4 (héjo sedeng), sarta P5 (héjo poék). Nilai P dicandak ku uji Kolmogorov-Smirnov dua-buntut. Percobaan diulang dua kali kalayan hasil anu sami.
Kituna, urang salajengna ditalungtik korelasi antara signalling ga sarta aktivitas division sél ku identifying tembok sél karek dibentuk salila assay nu (Gbr. 5e). Pendekatan ieu ngamungkinkeun urang pikeun ngukur frékuénsi sareng arah pamisahan sél. Ahéng, urang manggihan yén frékuénsi division sél dina IPR jeung sesa SAM (non-IPR, Gbr. 5f) éta sarupa, nunjukkeun yén béda dina signalling ga antara IPR jeung sél non-IPR teu mangaruhan signifikan division sél. Ieu, sareng korelasi positif antara sinyal GA sareng anisotropi pertumbuhan, nyababkeun urang mertimbangkeun naha kagiatan signalling GA tiasa mangaruhan orientasi pesawat divisi sél. Urang ngukur orientasi tina témbok sél anyar salaku sudut akut relatif ka sumbu radial nyambungkeun puseur meristem jeung puseur témbok sél anyar (Gbr. 5e-i) jeung observasi kacenderungan jelas pikeun sél ngabagi di sudut deukeut 90 ° relatif ka sumbu radial, jeung frékuénsi pangluhurna observasi dina 703-80 ° jeung 70-80 ° (703-80%). (22,62%) (Gbr. 5e, i), pakait jeung division sél dina circumferential / arah transverse (Gbr. 5h). Pikeun nalungtik kontribusi GA signalling kana kabiasaan division sél ieu, urang dianalisis parameter division sél dina IPR jeung non-IPR misah (Gbr. 5i). Urang niténan yén sebaran sudut division dina sél IPR béda ti éta dina sél non-IPR atawa dina sél dina sakabéh SAM, kalawan sél IPR exhibiting proporsi luhur divisi sél gurat / sirkular, nyaéta, 70-80 ° jeung 80-90 ° (33.86% jeung 30.71%, masing-masing, proporsi pakait Fig .5). Ku kituna, observasi kami ngungkabkeun hiji pakaitna antara signalling ga tinggi sarta orientasi pesawat division sél deukeut arah circumferential, sarupa jeung korelasi antara aktivitas signalling ga sarta anisotropi tumuwuhna (Gbr. 5c, d). Jang meberkeun ngadegkeun konservasi spasial pakaitna ieu, urang ngukur orientasi pesawat division dina sél IPR sabudeureun primordium mimitian ti P3, saprak kagiatan signalling GA pangluhurna dideteksi di wewengkon ieu mimitian ti P4 (Gbr. 4). Sudut division tina IPR sabudeureun P3 na P4 némbongkeun euweuh bédana signifikan sacara statistik, sanajan frékuénsi ngaronjat tina division sél gurat ieu observasi dina IPR sabudeureun P4 (Gbr. 5j). Sanajan kitu, dina sél IPR sabudeureun P5, bédana dina orientasi pesawat division sél jadi signifikan sacara statistik, kalawan ngaronjat seukeut dina frékuénsi division sél transverse (Gbr. 5j). Kalawan babarengan, hasil ieu nunjukkeun yén signalling GA bisa ngadalikeun orientasi bagean sél dina SAM, nu konsisten jeung reports saméméhna40,41 yén signalling GA tinggi bisa dipicuna orientasi gurat bagean sél dina IPR.
Diprediksi yén sél dina IPR moal diasupkeun kana primordia tapi rada kana internodes2,42,43. Orientasi transversal tina division sél dina IPR bisa ngakibatkeun organisasi has baris longitudinal paralel sél épidermis dina internodes. Pengamatan kami ditétélakeun di luhur nunjukkeun yén sinyal GA kamungkinan maénkeun peran dina prosés ieu ku ngatur arah pamisah sél.
Leungitna fungsi sababaraha gén DELLA nyababkeun réspon GA konstitutif, sareng mutan della tiasa dianggo pikeun nguji hipotésis ieu44. Urang mimiti nganalisis pola ekspresi lima gén DELLA dina SAM. Fusi transkripsional tina garis GUS45 ngungkabkeun yén GAI, RGA, RGL1, sareng RGL2 (kana tingkat anu langkung handap) dinyatakeun dina SAM (Suplemén Gbr. 11a-d). In situ hibridisasi salajengna nunjukkeun yén GAI mRNA accumulates husus dina primordia sarta ngembang kembang (Suplemén Gbr. 11e). RGL1 sareng RGL3 mRNA dideteksi sapanjang kanopi SAM sareng dina kembang anu langkung lami, sedengkeun RGL2 mRNA langkung seueur di daérah wates (Suplemén Gbr. 11f-h). Imaging Confocal of pRGL3 :: RGL3-GFP SAM dikonfirmasi éksprési observasi ku in situ hibridisasi sarta némbongkeun yén protéin RGL3 accumulates di bagian sentral tina Sam (Suplemén Gbr. 11i). Ngagunakeun pRGA :: garis GFP-RGA, kami ogé kapanggih yén protéin RGA accumulates di SAM, tapi kaayaanana na nurun di wates mimitian ti P4 (Suplemén Gbr. 11j). Utamana, pola ekspresi RGL3 na RGA konsisten kalayan aktivitas signalling GA luhur di IPR, sakumaha kauninga ku qmRGA (Gbr. 4). Leuwih ti éta, data ieu nunjukkeun yén sakabéh DELLAs dinyatakeun dina SAM sarta yén éksprési maranéhanana sacara koléktif ngawengku sakabéh SAM.
Urang salajengna dianalisis parameter division sél dina liar-tipe SAM (Ler, kontrol) jeung gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (global) mutants (Gbr. 6a, b). Narikna, urang niténan shift signifikan sacara statistik dina distribusi frékuénsi sudut division sél dina della global mutant Sam dibandingkeun tipe liar (Gbr. 6c). Ieu parobahan dina della global mutant éta alatan kanaékan frékuénsi sudut 80-90 ° (34,71% vs 24,55%) jeung, ka extent Lesser, sudut 70-80 ° (23,78% vs 20,18%), nyaéta, pakait jeung division sél transverse (Gbr. 6c). Frékuénsi divisi non-transverse (0-60 °) oge handap dina della global mutant (Gbr. 6c). Frékuénsi divisi sél transverse ieu nyata ngaronjat dina SAM tina della global mutant (Gbr. 6b). Frékuénsi divisi sél transverse dina IPR oge luhur di della global mutant dibandingkeun tipe liar (Gbr. 6d). Di luar wewengkon IPR, tipe liar miboga distribusi anu leuwih seragam tina sudut division sél, sedengkeun della global mutant pikaresep divisi tangensial kawas IPR (Gbr. 6e). Kami ogé ngitung orientasi divisi sél dina SAM ga2 oxidase (ga2ox) mutan quintuple (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, sareng ga2ox6-2), latar tukang mutant GA-inaktif dimana GA ngumpulkeun. Konsisten jeung kanaékan tingkat GA, SAM tina quintuple ga2ox mutant inflorescence éta leuwih badag batan Col-0 (Supplementary Gbr. 12a, b), sarta dibandingkeun Col-0, nu quintuple ga2ox SAM némbongkeun distribusi distinctly béda tina sudut division sél, kalawan frékuénsi sudut ngaronjatna ti 50 ° ka 90. 12a–c). Ku kituna, kami nunjukkeun yén aktivasina konstitutif tina sinyal GA sareng akumulasi GA nyababkeun pamisahan sél gurat dina IPR sareng sésa SAM.
a, b visualisasi 3D tina lapisan L1 of PI-patri Ler (a) jeung global della mutant (b) SAM maké mikroskop confocal. Tembok sél anyar anu kabentuk dina SAM (tapi sanés primordium) salami 10 jam ditampilkeun sareng diwarnaan dumasar kana nilai sudutna. Inset nembongkeun SAM dina 0 h. Bar warna dipintonkeun di pojok katuhu handap. Panah dina (b) nunjuk kana conto file sél anu dijajarkeun dina mutant della global. Percobaan diulang dua kali kalayan hasil anu sami. ce ngabandingkeun tina sebaran frékuénsi orientations pesawat division sél dina sakabéh SAM (d), IPR (e), sarta non-IPR (f) antara Ler na global della. Nilai P dicandak nganggo uji Kolmogorov-Smirnov dua buntut. f, g 3D visualisasi gambar confocal of PI-patri SAM of Col-0 (i) jeung pCUC2 :: gai-1-VENUS (j) tutuwuhan transgenik. Panels (a, b) nembongkeun tembok sél anyar (tapi teu primordia) kabentuk dina SAM dina 10 h. Percobaan diulang dua kali kalayan hasil anu sami. h–j Babandingan sebaran frékuénsi orientations pesawat division sél lokasina di sakabéh SAM (h), IPR (i) jeung non-IPR (j) antara Col-0 jeung pCUC2 :: gai-1-VENUS tutuwuhan. Nilai P dicandak nganggo uji Kolmogorov-Smirnov dua-buntut.
Urang salajengna nguji efek inhibiting GA signalling husus dina IPR. Pikeun tujuan ieu, kami nganggo cotyledon cup 2 (CUC2) promoter pikeun ngajalankeun éksprési protéin gai-1 négatip dominan ngahiji ka VENUS (dina garis pCUC2 :: gai-1-VENUS). Dina tipe liar SAM, promotor CUC2 nyorong éksprési kalolobaan IPR di SAM, kalebet sél wates, ti P4 teras, sareng éksprési spésifik anu sami dititénan dina pCUC2 :: gai-1-VENUS tutuwuhan (tempo di handap). Sebaran sudut division sél sakuliah SAM atanapi IPR pCUC2 :: gai-1-VENUS tutuwuhan teu béda signifikan ti tipe liar, sanajan teu disangka urang manggihan yén sél tanpa IPR dina tutuwuhan ieu dibagi dina frékuénsi luhur 80-90 ° (Gbr. 6f-j).
Eta geus ngusulkeun yén arah division sél gumantung kana géométri SAM, hususna tegangan tensile dihasilkeun ku curvature jaringan46. Ku kituna kami naroskeun naha bentuk SAM dirobih dina mutant global della sareng pCUC2 :: gai-1-VENUS tutuwuhan. Salaku dilaporkeun saméméhna12, ukuran della global mutant SAM leuwih badag batan tipe liar (Suplemén Gbr. 13a, b, d). In situ hibridisasi CLV3 na STM RNA dikonfirmasi ékspansi meristem di della mutants sarta salajengna némbongkeun ékspansi gurat tina Ecological sél sirung (Suplemén Gbr. 13e, f, h, i). Sanajan kitu, curvature SAM éta sarupa dina duanana genotypes (Suplemén Gbr. 13k, m, n, p). Urang observasi kanaékan sarupa dina ukuran dina gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della quadruple mutant tanpa parobahan curvature dibandingkeun tipe liar (Suplemén Gbr. 13c, d, g, j, l, o, p). Frékuénsi orientasi division sél ieu ogé kapangaruhan dina della quadruple mutant, tapi mun extent Lesser ti di della monolithic mutant (Supplementary Gbr. 12d-f). Pangaruh dosis ieu, sareng kurangna pangaruh kana curvature, nunjukkeun yén sésa aktivitas RGL3 dina Della quadruple mutant ngabatesan parobahan dina orientasi division sél disababkeun ku leungitna aktivitas DELLA sarta yén parobahan dina division sél gurat lumangsung dina respon kana parobahan dina aktivitas signalling ga tinimbang parobahan dina géométri SAM. Sakumaha ditétélakeun di luhur, promoter CUC2 ngajalankeun éksprési IPR dina SAM dimimitian dina P4 (Suplemén Gbr. 14a, b), sarta sabalikna, pCUC2 :: gai-1-VENUS SAM miboga ukuran ngurangan tapi curvature luhur (Suplemén Gbr. 14c-h). Parobahan dina pCUC2:: gai-1-VENUS SAM morfologi bisa ngahasilkeun sebaran béda tina stresses mékanis dibandingkeun tipe liar, nu stresses circumferential tinggi dimimitian dina jarak pondok ti puseur SAM47. Alternatipna, parobahan dina pCUC2:: gai-1-VENUS SAM morfologi bisa hasil tina parobahan dina sipat mékanis régional ngainduksi ku ekspresi transgene48. Dina dua kasus, ieu sawaréh tiasa ngimbangan épék parobahan dina sinyal GA ku cara ningkatkeun kamungkinan yén sél bakal ngabagi dina orientasi circumferential / transverse, ngajelaskeun observasi urang.
Dihijikeun, data kami mastikeun yén sinyal GA anu langkung luhur maénkeun peran aktip dina orientasi gurat pesawat division sél dina IPR. Éta ogé nunjukkeun yén curvature meristem ogé mangaruhan orientasi bidang division sél dina IPR.
Orientasi transverse tina pesawat division dina IPR, alatan aktivitas signalling GA tinggi, nunjukkeun yen GA pre-organizes file sél radial dina épidermis dina SAM pikeun nangtukeun organisasi sélular nu engké bakal kapanggih dina internode épidermis. Mémang, file sél sapertos sering katingali dina gambar SAM tina mutan global della (Gbr. 6b). Ku kituna, jang meberkeun ngajajah fungsi developmental tina pola spasial sinyal GA dina SAM, urang ngagunakeun time-lapse Imaging pikeun nganalisis organisasi spasial sél dina IPR di liar-tipe (Ler na Col-0), della mutants global, sarta pCUC2 :: gai-1-VENUS tutuwuhan transgenik.
Kami mendakan yén qmRGA nunjukkeun yén kagiatan sinyal GA dina IPR ningkat tina P1 / P2 sareng puncak dina P4, sareng pola ieu tetep konstan dina waktosna (Gbr. 4a-f sareng Gbr. 8c-f, k). Pikeun nganalisis organisasi spasial sél dina IPR kalayan ngaronjatna sinyal GA, urang dilabélan sél Ler IPR luhur jeung ka sisi P4 nurutkeun nasib developmental maranéhanana dianalisis 34 h sanggeus observasi munggaran, nyaéta, leuwih ti dua kali plastid, sahingga urang nuturkeun sél IPR salila ngembangkeun primordium ti P1 / P2 mun P4. Kami nganggo tilu warna anu béda: konéng pikeun sél anu diintegrasikeun kana primordium caket P4, héjo pikeun anu aya dina IPR, sareng wungu pikeun anu milu dina duanana prosés (Gbr. 7a-c). Dina t0 (0 h), 1-2 lapisan sél IPR éta katingali di hareup P4 (Gbr. 7a). Saperti nu diharapkeun, nalika sél ieu dibagi, maranéhna ngalakukeun kitu utamana ngaliwatan pesawat division transversal (Gbr. 7a-c). Hasil anu sami dicandak nganggo Col-0 SAM (fokus kana P3, anu watesna ngalipet sami sareng P4 di Ler), sanaos dina genotip ieu lipatan anu kabentuk dina wates kembang nyumput sél IPR langkung gancang (Gbr. 7g-i). Ku kituna, pola division sél IPR pre-organizes sél kana baris radial, sakumaha dina internodes. Organisasi baris radial jeung lokalisasi sél IPR antara organ saterusna nunjukkeun yén sél ieu progenitor internodal.
Di dieu, urang ngembangkeun hiji ratiometric GA signalling biosensor, qmRGA, anu ngamungkinkeun para pemetaan kuantitatif aktivitas signalling GA hasil tina gabungan GA jeung konsentrasi reséptor GA bari ngaminimalkeun gangguan jeung jalur signalling endogenous, kukituna nyadiakeun informasi ngeunaan fungsi GA di tingkat sélulér. Pikeun tujuan ieu, kami ngawangun protéin DELLA anu dirobih, mRGA, anu kaleungitan kamampuan pikeun ngabeungkeut mitra interaksi DELLA tapi tetep sénsitip kana proteolisis anu ngainduksi GA. qmRGA ngabales duanana parobahan exogenous na endogenous dina tingkat GA, sarta sipat sensing dinamis na ngamungkinkeun assessment parobahan spasiotemporal dina aktivitas signalling ga salila ngembangkeun. qmRGA oge alat pisan fléksibel sabab bisa diadaptasi kana jaringan béda ku cara ngarobah promoter dipaké pikeun éksprési na (lamun perlu), sarta dibere alam conserved tina jalur signalling GA jeung motif PFYRE sakuliah angiosperms, éta kamungkinan bisa transferable ka spésiés séjén22. Konsisten jeung ieu, hiji mutasi sarimbag dina protéin SLR1 DELLA béas (HYY497AAA) ogé ditémbongkeun pikeun ngurangan aktivitas repressor pertumbuhan SLR1 bari ngan rada ngurangan degradasi GA-dimédiasi na, sarupa jeung mRGA23. Utamana, panilitian panganyarna dina Arabidopsis nunjukkeun yén mutasi asam amino tunggal dina domain PFYRE (S474L) ngarobih kagiatan transkripsi RGA tanpa mangaruhan kamampuan berinteraksi sareng mitra faktor transkripsi50. Sanaos mutasi ieu caket pisan sareng 3 substitusi asam amino anu aya dina mRGA, panilitian kami nunjukkeun yén dua mutasi ieu ngarobih ciri anu béda tina DELLA. Sanaos kalolobaan mitra faktor transkripsi ngabeungkeut kana domain LHR1 sareng SAW DELLA26,51, sababaraha asam amino anu dilestarikan dina domain PFYRE tiasa ngabantosan nyaimbangkeun interaksi ieu.
Pangembangan internode mangrupikeun ciri konci dina arsitéktur pepelakan sareng paningkatan hasil. qmRGA ngungkabkeun kagiatan sinyal GA anu langkung luhur dina sél progenitor internode IPR. Ku ngagabungkeun pencitraan kuantitatif sareng genetika, kami nunjukkeun yén pola sinyal GA superimpose planes division sél sirkular / transverse dina épidermis SAM, shaping organisasi division sél diperlukeun pikeun ngembangkeun internode. Sababaraha régulator orientasi pesawat division sél geus dicirikeun salila development52,53. Karya urang nyadiakeun conto jelas kumaha kagiatan signalling GA ngatur parameter sélular ieu. DELLA tiasa berinteraksi sareng kompleks protéin prefolding41, ku kituna sinyal GA tiasa ngatur orientasi pesawat division sél ku langsung mangaruhan orientasi microtubule cortical40,41,54,55. Kami teu disangka-sangka nunjukkeun yén dina SAM, korélasi kagiatan sinyal GA anu langkung luhur sanés pemanjangan sél atanapi pamisahan, tapi ngan ukur anisotropi pertumbuhan, anu konsisten sareng pangaruh langsung GA dina arah pamisahan sél dina IPR. Najan kitu, urang teu bisa ngaluarkeun yén pangaruh ieu ogé bisa jadi teu langsung, contona dimédiasi ku ga-ngainduksi témbok sél softening56. Parobahan dina sipat témbok sél ngainduksi stress mékanis57,58, nu ogé bisa pangaruh orientasi pesawat division sél ku mangaruhan orientasi microtubules cortical39,46,59. Balukar gabungan tina setrés mékanis anu ngainduksi GA sareng pangaturan langsung orientasi microtubule ku GA tiasa kalibet dina ngahasilkeun pola khusus orientasi division sél dina IPR pikeun nangtukeun internodes, sareng studi salajengna diperyogikeun pikeun nguji ide ieu. Nya kitu, studi saméméhna geus disorot pentingna tina DELLA-interacting protéin TCP14 na 15 dina kadali formasi internode60,61 jeung faktor ieu bisa nyapih Peta ga bareng jeung BREVIPEDICELLUS (BP) jeung PENNYWISE (PNY), nu ngatur ngembangkeun internode sarta geus ditémbongkeun pangaruh ga signalling2,62. Nunjukkeun yen DELLAs berinteraksi sareng brassinosteroid, étiléna, asam jasmonic, sarta asam abscisic (ABA) signalling pathways63,64 sarta yén hormon ieu bisa mangaruhan microtubule orientation65, épék GA dina orientasi division sél ogé bisa dimédiasi ku hormon séjén.
Studi cytological mimiti némbongkeun yén duanana wewengkon jero jeung luar Arabidopsis SAM diperlukeun pikeun ngembangkeun internode2,42. Kanyataan yén GA sacara aktip ngatur pamisahan sél dina jaringan jero12 ngadukung fungsi ganda GA dina ngatur ukuran meristem sareng internode dina SAM. Pola division sél arah ogé diatur pageuh dina jaringan SAM jero, sarta pangaturan ieu penting pisan pikeun tumuwuh batang52. Bakal jadi istiméwa pikeun nalungtik naha GA ogé maénkeun peran dina orienting pesawat division sél dina organisasi SAM jero, kukituna nyingkronkeun spésifikasi sarta ngembangkeun internodes dina SAM.
Tutuwuhan anu tumuwuh in vitro dina taneuh atawa 1x Murashige-Skoog (MS) sedeng (Duchefa) supplemented kalawan 1% sukrosa jeung 1% agar (Sigma) dina kaayaan baku (16 h cahaya, 22 °C), iwal hypocotyl sarta percobaan pertumbuhan akar nu bibit anu tumuwuh dina pelat nangtung dina lampu konstan jeung 22 °C. Pikeun ékspérimén nitrat, pepelakan dipelak dina médium MS anu dimodifikasi (médium tutuwuhan bioWORLD) ditambah ku nitrat anu nyukupan (0 atanapi 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-succinate, 1% sukrosa sareng 1% A-agar (Sigma) dina kaayaan anu panjang.
GID1a cDNA diselapkeun kana pDONR221 ieu recombined kalawan pDONR P4-P1R-pUBQ10 na pDONR P2R-P3-mCherry kana pB7m34GW pikeun ngahasilkeun pUBQ10 :: GID1a-mCherry. DNA IDD2 diselapkeun kana pDONR221 ieu recombined kana pB7RWG266 ngahasilkeun p35S: IDD2-RFP. Pikeun ngahasilkeun pGID1b:: 2xmTQ2-GID1b, sempalan 3.9 kb di hulu wilayah coding GID1b sareng sempalan 4.7 kb anu ngandung GID1b cDNA (1.3 kb) sareng terminator (3.4 kb) munggaran diamplifikasi nganggo primers dina PNR1P sareng teras diselapkeun PNR1P4P 3. Fisher Scientific) sareng pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), masing-masing, sareng tungtungna digabungkeun deui sareng pDONR221 2xmTQ268 kana vektor target pGreen 012567 nganggo kloning Gateway. Pikeun ngahasilkeun pCUC2 :: LSSmOrange, runtuyan promoter CUC2 (3229 bp hulu ATG) dituturkeun ku runtuyan coding of Stokes-shifted mOrange badag (LSSmOrange) 69 jeung sinyal lokalisasi nuklir N7 jeung NOS terminator transcriptional dirakit kana pGreen3 recomming véktor véktor fragmen kanamycin. (Invitrogen). Vektor binér tutuwuhan diwanohkeun kana Agrobacterium tumefaciens galur GV3101 sarta diwanohkeun kana daun Nicotiana benthamiana ku métode infiltrasi Agrobacterium jeung kana Arabidopsis thaliana Col-0 ku métode dip kembang, masing-masing. pUBQ10 :: qmRGA pUBQ10 :: GID1a-mCherry na pCLV3 :: mCherry-NLS qmRGA diisolasi tina F3 jeung F1 progenies tina crosses masing-masing.
Hibridisasi RNA in situ dilakukeun dina kiat pucuk panjang kira-kira 1 cm72, anu dikumpulkeun sareng langsung dibereskeun dina larutan FAA (3,7% formaldehida, 5% asam asétat, 50% étanol) tos tiis dugi ka 4 °C. Saatos perlakuan vakum 2 × 15 mnt, fixative dirobih sareng sampel diinkubasi sapeuting. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, sarta RGL3 cDNAs jeung panyilidikan antisense ka 3′-UTRs maranéhanana anu disintésis ngagunakeun primers ditémbongkeun dina Table tambahan 3 sakumaha ditétélakeun ku Rosier et al.73. Panyilidikan digoxigenin-dilabélan immunodetected maké antibodi digoxigenin (3000-melu éncér; Roche, jumlah katalog: 11 093 274 910), sarta bagian anu diwarnaan ku 5-bromo-4-chloro-3-indolyl fosfat (BCIP, 250-folder nitrobluetiontrafold)-BT éncér) solusi.
waktos pos: Feb-10-2025