Tumuwuhna meristem apikal pucuk (SAM) penting pisan pikeun arsitéktur batang. Hormon tutuwuhangiberelin(GA) maénkeun peran konci dina koordinasi kamekaran pepelakan, tapi peranna dina SAM masih kurang kahartos. Di dieu, urang ngembangkeun biosensor rasiometrik tina sinyal GA ku cara ngarékayasa protéin DELLA pikeun ngurangan fungsi pangaturan pentingna dina réspon transkripsi GA bari ngajaga degradasi na nalika pangakuan GA. Urang nunjukkeun yén biosensor dumasar degradasi ieu sacara akurat ngarékam parobahan dina tingkat GA sareng panginderaan sélular salami pamekaran. Urang nganggo biosensor ieu pikeun memetakan aktivitas sinyal GA dina SAM. Urang nunjukkeun yén sinyal GA anu luhur aya utamina dina sél anu aya di antara primordia organ, anu mangrupikeun prékursor pikeun sél internode. Ngagunakeun pendekatan gain- sareng loss-of-function, urang salajengna nunjukkeun yén GA ngatur orientasi bidang divisi sél, ngadegkeun organisasi sélular kanonik tina internode, sahingga ngamajukeun spésifikasi internode dina SAM.
Meristem apikal pucuk (SAM), anu aya di puncak pucuk, ngandung relung sél stém anu aktivitasna ngahasilkeun organ lateral sareng simpul batang sacara modular sareng iteratif sapanjang hirup pepelakan. Masing-masing unit anu ngulang ieu, atanapi simpul pepelakan, kalebet internode sareng organ lateral dina simpul, sareng meristem aksila dina aksil daun1. Tumuwuhna sareng organisasi simpul pepelakan robih salami kamekaran. Dina Arabidopsis, pertumbuhan internode ditindas salami tahap vegetatif, sareng meristem aksila tetep teu aktip dina aksil daun roset. Salila transisi ka fase kembang, SAM janten meristem infloresensi, ngahasilkeun internode anu manjang sareng kuncup aksila, cabang dina aksil daun cauline, sareng engkéna, kembang anu teu aya daun2. Sanaos urang parantos ngadamel kamajuan anu signifikan dina ngartos mékanisme anu ngontrol inisiasi daun, kembang, sareng dahan, relatif sakedik anu dipikanyaho ngeunaan kumaha internode muncul.
Ngartos distribusi spatiotemporal GA bakal ngabantosan pikeun langkung ngartos fungsi hormon ieu dina jaringan anu béda sareng dina tahapan perkembangan anu béda. Visualisasi degradasi fusi RGA-GFP anu diekspresikeun dina tindakan promotorna nyalira nyayogikeun inpormasi penting ngeunaan pangaturan tingkat GA total dina akar15,16. Nanging, éksprési RGA rupa-rupa di sakumna jaringan17 sareng diatur ku GA18. Ku kituna, éksprési diferensial promotor RGA tiasa nyababkeun pola fluoresensi anu dititénan sareng RGA-GFP sahingga metode ieu henteu kuantitatif. Langkung anyar, bioaktif fluorescein (Fl)-dilabel GA19,20 ngungkabkeun akumulasi GA dina endokorteks akar sareng pangaturan tingkat sélulérna ku transportasi GA. Anyar-anyar ieu, sensor GA FRET nlsGPS1 nunjukkeun yén tingkat GA berkorelasi sareng pemanjangan sél dina akar, filamén, sareng hipokotil anu poék21. Nanging, sapertos anu urang tingali, konsentrasi GA sanés hiji-hijina parameter anu ngontrol aktivitas sinyal GA, sabab gumantung kana prosés sensing anu rumit. Di dieu, dumasar kana pamahaman urang ngeunaan jalur sinyal DELLA sareng GA, urang ngalaporkeun pamekaran sareng karakterisasi biosensor ratiometrik dumasar degradasi pikeun sinyal GA. Pikeun ngembangkeun biosensor kuantitatif ieu, urang nganggo RGA sénsitip GA mutan anu ngahiji kana protéin fluoresensi sareng diekspresikan sacara umum dina jaringan, ogé protéin fluoresensi anu teu sénsitip GA. Urang nunjukkeun yén fusi protéin RGA mutan henteu ngaganggu sinyal GA endogén nalika diekspresikan sacara umum, sareng yén biosensor ieu tiasa ngitung aktivitas sinyal anu dihasilkeun tina input GA sareng pamrosésan sinyal GA ku alat sensing kalayan résolusi spatiotemporal anu luhur. Urang nganggo biosensor ieu pikeun memetakan distribusi spatiotemporal tina aktivitas sinyal GA sareng ngitung kumaha GA ngatur paripolah sélular dina épidermis SAM. Urang nunjukkeun yén GA ngatur orientasi bidang divisi sél SAM anu aya di antara primordia organ, ku kituna ngahartikeun organisasi sélular kanonik tina internode.
Pamungkas, urang naroskeun naha qmRGA tiasa ngalaporkeun parobahan dina tingkat GA endogén nganggo hipokotil anu nuju tumuwuh. Kami sateuacanna nunjukkeun yén nitrat ngarangsang kamekaran ku cara ningkatkeun sintésis GA sareng, kahareupna, degradasi DELLA34. Sasuai sareng éta, urang niténan yén panjang hipokotil dina bibit pUBQ10::qmRGA anu dipelak dina suplai nitrat anu seueur (10 mM NO3−) sacara signifikan langkung panjang tibatan dina bibit anu dipelak dina kaayaan kakurangan nitrat (Gambar Tambahan 6a). Saluyu sareng réspon kamekaran, sinyal GA langkung luhur dina hipokotil bibit anu dipelak dina kaayaan 10 mM NO3− tibatan dina bibit anu dipelak dina henteuna nitrat (Gambar Tambahan 6b, c). Ku kituna, qmRGA ogé ngamungkinkeun ngawaskeun parobahan dina sinyal GA anu diinduksi ku parobahan endogén dina konsentrasi GA.
Pikeun ngartos naha aktivitas sinyal GA anu dideteksi ku qmRGA gumantung kana konsentrasi GA sareng persépsi GA, sapertos anu dipiharep dumasar kana desain sensor, kami nganalisis éksprési tilu reséptor GID1 dina jaringan vegetatif sareng réproduktif. Dina bibit, garis reporter GID1-GUS nunjukkeun yén GID1a sareng c diekspresikan pisan dina kotiledon (Gambar 3a–c). Salaku tambahan, sadaya tilu reséptor diekspresikan dina daun, primordia akar lateral, ujung akar (kajaba tutup akar GID1b), sareng sistem vaskular (Gambar 3a–c). Dina SAM infloresensi, kami ngadeteksi sinyal GUS ngan ukur pikeun GID1b sareng 1c (Gambar Tambahan 7a–c). Hibridisasi in situ mastikeun pola éksprési ieu sareng salajengna nunjukkeun yén GID1c diekspresikan sacara seragam dina tingkat anu handap dina SAM, sedengkeun GID1b nunjukkeun éksprési anu langkung luhur di pinggiran SAM (Gambar Tambahan 7d–l). Fusi translasi pGID1b::2xmTQ2-GID1b ogé ngungkabkeun rentang éksprési GID1b anu dinilai, ti éksprési anu handap atanapi henteu aya di tengah SAM dugi ka éksprési anu luhur di wates organ (Gambar Tambahan 7m). Ku kituna, reséptor GID1 henteu disebarkeun sacara seragam di sakuliah sareng di jero jaringan. Dina ékspérimén salajengna, urang ogé niténan yén éksprési GID1 anu kaleuleuwihi (pUBQ10::GID1a-mCherry) ningkatkeun sensitivitas qmRGA dina hipokotil kana aplikasi GA éksternal (Gambar 3d, e). Sabalikna, fluoresensi anu diukur ku qd17mRGA dina hipokotil henteu sénsitip kana perlakuan GA3 (Gambar 3f, g). Pikeun duanana uji, bibit dirawat ku konsentrasi GA anu luhur (100 μM GA3) pikeun meunteun paripolah gancang sénsor, dimana kamampuan pikeun ngabeungkeut kana reséptor GID1 ningkat atanapi leungit. Sacara gembleng, hasil ieu mastikeun yén biosensor qmRGA ngalayanan fungsi gabungan salaku sensor GA sareng GA, sareng nunjukkeun yén éksprési diferensial reséptor GID1 tiasa sacara signifikan ngamodulasi émisivitas sensor.
Nepi ka ayeuna, distribusi sinyal GA dina SAM masih teu jelas. Ku kituna, urang nganggo tutuwuhan anu ngébréhkeun qmRGA sareng reporter sél stém pCLV3::mCherry-NLS35 pikeun ngitung peta kuantitatif résolusi luhur tina aktivitas sinyal GA, fokus kana lapisan L1 (épidermis; Gambar 4a, b, tingali Métode sareng Métode Tambahan), kumargi L1 maénkeun peran konci dina ngontrol kamekaran SAM36. Di dieu, éksprési pCLV3::mCherry-NLS nyayogikeun titik rujukan géométri anu tetep pikeun nganalisis distribusi spatiotemporal tina aktivitas sinyal GA37. Sanaos GA dianggap penting pikeun kamekaran organ lateral4, urang niténan yén sinyal GA rendah dina primordium kembang (P) dimimitian ti tahap P3 (Gambar 4a, b), sedengkeun primordium P1 sareng P2 ngora ngagaduhan aktivitas sedeng anu sami sareng anu aya di daérah tengah (Gambar 4a, b). Aktivitas sinyal GA anu langkung luhur dideteksi di wates primordium organ, dimimitian ti P1/P2 (di sisi wates) sareng puncakna di P4, ogé di sadaya sél daérah periferal anu aya di antara primordia (Gambar 4a, b sareng Gambar Tambahan 8a, b). Aktivitas sinyal GA anu langkung luhur ieu dititénan henteu ngan ukur di épidermis tapi ogé di lapisan L2 sareng L3 luhur (Gambar Tambahan 8b). Pola sinyal GA anu dideteksi dina SAM nganggo qmRGA ogé tetep teu robih kana waktosna (Gambar Tambahan 8c–f, k). Sanaos konstruksi qd17mRGA sacara sistematis dikirangan dina SAM pepelakan T3 tina lima garis mandiri anu kami cirian sacara rinci, kami tiasa nganalisis pola fluoresensi anu diala ku konstruksi pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP (Gambar Tambahan 8g–j, l). Dina garis kontrol ieu, ngan ukur parobahan minor dina rasio fluoresensi anu dideteksi dina SAM, tapi di puseur SAM kami niténan panurunan VENUS anu jelas sareng teu kaduga anu aya hubunganana sareng TagBFP. Ieu mastikeun yén pola sinyal anu dititénan ku qmRGA ngagambarkeun degradasi mRGA-VENUS anu gumantung kana GA, tapi ogé nunjukkeun yén qmRGA tiasa ngaleuwihan aktivitas sinyal GA di puseur meristem. Singkatna, hasil kami ngungkabkeun pola sinyal GA anu utamina ngagambarkeun distribusi primordia. Distribusi daérah antar-primordial (IPR) ieu disababkeun ku ayana aktivitas sinyal GA anu luhur sacara bertahap antara primordium anu berkembang sareng daérah puseur, sedengkeun dina waktos anu sami aktivitas sinyal GA dina primordium nurun (Gambar 4c, d).
Distribusi reséptor GID1b sareng GID1c (tingali di luhur) nunjukkeun yén éksprési diferensial reséptor GA ngabantosan ngabentuk pola aktivitas sinyal GA dina SAM. Kami panasaran naha akumulasi diferensial GA tiasa kalibet. Pikeun nalungtik kamungkinan ieu, kami nganggo sénsor FRET GA nlsGPS121. Frékuénsi aktivasi anu ningkat dideteksi dina SAM nlsGPS1 anu dirawat ku 10 μM GA4+7 salami 100 menit (Gambar Tambahan 9a–e), nunjukkeun yén nlsGPS1 ngaréspon kana parobahan konsentrasi GA dina SAM, sapertos dina akar21. Distribusi spasial frékuénsi aktivasina nlsGPS1 ngungkabkeun tingkat GA anu relatif handap dina lapisan luar SAM, tapi nunjukkeun yén éta ningkat di tengah sareng di wates SAM (Gambar 4e sareng Gambar Tambahan 9a,c). Ieu nunjukkeun yén GA ogé disebarkeun dina SAM kalayan pola spasial anu sami sareng anu diungkabkeun ku qmRGA. Salaku pendekatan anu saling ngalengkepan, urang ogé ngubaran SAM nganggo GA fluoresensi (GA3-, GA4-, GA7-Fl) atanapi Fl nyalira salaku kontrol négatip. Sinyal Fl disebarkeun ka sakumna SAM, kalebet daérah tengah sareng primordium, sanaos dina inténsitas anu langkung handap (Gambar 4j sareng Gambar Tambahan 10d). Sabalikna, sadaya tilu GA-Fl akumulasi khusus dina wates primordium sareng dina tingkat anu béda-béda dina sésa IPR, kalayan GA7-Fl akumulasi dina domain panggedéna dina IPR (Gambar 4k sareng Gambar Tambahan 10a, b). Kuantifikasi inténsitas fluoresensi ngungkabkeun yén babandingan inténsitas IPR ka non-IPR langkung luhur dina SAM anu dirawat GA-Fl dibandingkeun sareng SAM anu dirawat Fl (Gambar 4l sareng Gambar Tambahan 10c). Sacara babarengan, hasil ieu nunjukkeun yén GA aya dina konsentrasi anu langkung luhur dina sél IPR anu ayana pangdeukeutna kana wates organ. Ieu nunjukkeun yén pola aktivitas sinyal SAM GA hasil tina éksprési diferensial reséptor GA sareng akumulasi diferensial GA dina sél IPR caket wates organ. Ku kituna, analisis kami ngungkabkeun pola spatiotemporal pensinyalan GA anu teu kaduga, kalayan aktivitas anu langkung handap di tengah sareng primordium SAM sareng aktivitas anu langkung luhur dina IPR di daérah periferal.
Pikeun ngartos peran aktivitas sinyal GA diferensial dina SAM, urang nganalisis korélasi antara aktivitas sinyal GA, ékspansi sél, sareng divisi sél nganggo pencitraan time-lapse sacara real-time tina SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Kusabab peran GA dina pangaturan kamekaran, korélasi positif sareng parameter ékspansi sél dipiharep. Ku alatan éta, urang mimitina ngabandingkeun peta aktivitas sinyal GA sareng peta laju kamekaran permukaan sél (salaku proksi pikeun kakuatan ékspansi sél pikeun sél anu dipasihkeun sareng pikeun sél anak nalika divisi) sareng sareng peta anisotropi kamekaran, anu ngukur arah ékspansi sél (ogé dianggo di dieu pikeun sél anu dipasihkeun sareng pikeun sél anak nalika divisi; Gambar 5a,b, tingali Métode sareng Métode Tambahan). Peta laju kamekaran permukaan sél SAM urang saluyu sareng observasi sateuacana38,39, kalayan laju kamekaran minimal di wates sareng laju kamekaran maksimal dina kembang anu berkembang (Gambar 5a). Analisis komponén utama (PCA) nunjukkeun yén aktivitas sinyal GA berkorelasi négatif sareng inténsitas kamekaran permukaan sél (Gambar 5c). Kami ogé nunjukkeun yén sumbu variasi utama, kalebet input sinyal GA sareng inténsitas kamekaran, ortogonal kana arah anu ditangtukeun ku éksprési CLV3 anu luhur, anu mastikeun yén sél henteu dikaluarkeun tina puseur SAM dina analisis anu sésana. Analisis korélasi Spearman mastikeun hasil PCA (Gambar 5d), nunjukkeun yén sinyal GA anu langkung luhur dina IPR henteu nyababkeun ékspansi sél anu langkung luhur. Nanging, analisis korélasi ngungkabkeun korélasi positip anu sakedik antara aktivitas sinyal GA sareng anisotropi kamekaran (Gambar 5c, d), nunjukkeun yén sinyal GA anu langkung luhur dina IPR mangaruhan arah kamekaran sél sareng kamungkinan posisi bidang divisi sél.
a, b Peta panas rata-rata kamekaran permukaan (a) sareng anisotropi kamekaran (b) dina SAM dirata-ratakeun kana tujuh pepelakan mandiri (masing-masing dianggo salaku proksi pikeun kakuatan sareng arah ékspansi sél). c Analisis PCA kalebet variabel ieu: sinyal GA, inténsitas kamekaran permukaan, anisotropi kamekaran permukaan, sareng éksprési CLV3. Komponén PCA 1 utamina berkorelasi négatif sareng inténsitas kamekaran permukaan sareng berkorelasi positif sareng sinyal GA. Komponén PCA 2 utamina berkorelasi positif sareng anisotropi kamekaran permukaan sareng berkorelasi négatif sareng éksprési CLV3. Perséntase ngagambarkeun variasi anu dijelaskeun ku unggal komponén. d Analisis korélasi Spearman antara sinyal GA, inténsitas kamekaran permukaan, sareng anisotropi kamekaran permukaan dina skala jaringan teu kalebet CZ. Angka di katuhu nyaéta nilai rho Spearman antara dua variabel. Asterisk nunjukkeun kasus dimana korélasi/korélasi négatif penting pisan. e Visualisasi 3D sél Col-0 SAM L1 ku mikroskop confocal. Dinding sél anyar anu kabentuk dina SAM (tapi sanés primordium) dina 10 jam diwarnaan numutkeun nilai sudutna. Bilah warna dipidangkeun di pojok katuhu handap. Sisipan nunjukkeun gambar 3D anu saluyu dina jam 0. Ékspérimén ieu diulang dua kali kalayan hasil anu sami. f Plot kotak nampilkeun laju divisi sél dina IPR sareng non-IPR Col-0 SAM (n = 10 pepelakan mandiri). Garis tengah nunjukkeun median, sareng wates kotak nunjukkeun persentil ka-25 sareng ka-75. Kumis nunjukkeun nilai minimum sareng maksimum anu ditangtukeun ku parangkat lunak R. Nilai P diala ku uji-t dua sisi Welch. g, h Diagram skematis anu nunjukkeun (g) kumaha ngukur sudut témbok sél anyar (magenta) anu aya hubunganana sareng arah radial ti puseur SAM (garis putus-putus bodas) (ngan ukur nilai sudut akut, nyaéta, 0–90°, anu dipertimbangkeun), sareng (h) arah sirkumferensial/lateral sareng radial dina meristem. i Histogram frékuénsi orientasi bidang divisi sél di sakuliah SAM (biru poék), IPR (biru sedeng), sareng non-IPR (biru ngora), masing-masing. Nilai P diala ku uji Kolmogorov-Smirnov dua sisi. Ékspérimén ieu diulang dua kali kalayan hasil anu sami. j Histogram frékuénsi orientasi bidang divisi sél IPR di sakitar P3 (héjo ngora), P4 (héjo sedeng), sareng P5 (héjo poék), masing-masing. Nilai P diala ku uji Kolmogorov-Smirnov dua sisi. Ékspérimén ieu diulang dua kali kalayan hasil anu sami.
Ku kituna, salajengna urang nalungtik korélasi antara sinyal GA sareng aktivitas divisi sél ku cara ngaidentipikasi témbok sél anu nembé kabentuk salami uji (Gambar 5e). Pendekatan ieu ngamungkinkeun urang pikeun ngukur frékuénsi sareng arah divisi sél. Anu anéh, urang mendakan yén frékuénsi divisi sél dina IPR sareng sésana SAM (non-IPR, Gambar 5f) sami, nunjukkeun yén bédana dina sinyal GA antara sél IPR sareng non-IPR henteu mangaruhan sacara signifikan divisi sél. Ieu, sareng korélasi positif antara sinyal GA sareng anisotropi kamekaran, ngadorong urang pikeun mertimbangkeun naha aktivitas sinyal GA tiasa mangaruhan orientasi bidang divisi sél. Kami ngukur orientasi témbok sél anyar salaku sudut seukeut relatif ka sumbu radial anu nyambungkeun puseur meristem sareng puseur témbok sél anyar (Gambar 5e-i) sareng niténan kacenderungan anu jelas pikeun sél pikeun ngabagi dina sudut caket 90° relatif ka sumbu radial, kalayan frékuénsi pangluhurna anu dititénan dina 70–80° (23,28%) sareng 80–90° (22,62%) (Gambar 5e,i), anu saluyu sareng divisi sél dina arah sirkumférensial/transversal (Gambar 5h). Pikeun nalungtik kontribusi sinyal GA kana paripolah divisi sél ieu, kami nganalisis parameter divisi sél dina IPR sareng non-IPR sacara misah (Gambar 5i). Kami niténan yén distribusi sudut divisi dina sél IPR béda ti sél non-IPR atanapi dina sél dina sakabéh SAM, kalayan sél IPR nunjukkeun proporsi divisi sél lateral/sirkular anu langkung luhur, nyaéta, 70–80° sareng 80–90° (masing-masing 33,86% sareng 30,71%, proporsi anu saluyu) (Gambar 5i). Ku kituna, observasi kami ngungkabkeun hubungan antara sinyal GA anu luhur sareng orientasi bidang divisi sél anu caket kana arah sirkumferensial, sami sareng korélasi antara aktivitas sinyal GA sareng anisotropi pertumbuhan (Gambar 5c, d). Pikeun langkung netepkeun konservasi spasial tina asosiasi ieu, kami ngukur orientasi bidang divisi dina sél IPR anu ngurilingan primordium dimimitian ti P3, kumargi aktivitas sinyal GA pangluhurna dideteksi di daérah ieu dimimitian ti P4 (Gambar 4). Sudut divisi IPR di sakitar P3 sareng P4 henteu nunjukkeun béda anu signifikan sacara statistik, sanaos frékuénsi divisi sél lateral anu ningkat dititénan dina IPR di sakitar P4 (Gambar 5j). Nanging, dina sél IPR di sakitar P5, bédana dina orientasi bidang divisi sél janten signifikan sacara statistik, kalayan paningkatan anu seukeut dina frékuénsi divisi sél transversal (Gambar 5j). Sacara babarengan, hasil ieu nunjukkeun yén sinyal GA tiasa ngontrol orientasi divisi sél dina SAM, anu saluyu sareng laporan sateuacana40,41 yén sinyal GA anu luhur tiasa ngainduksi orientasi lateral divisi sél dina IPR.
Diprediksi yén sél dina IPR moal dilebetkeun kana primordia tapi kana internode2,42,43. Orientasi transversal tina divisi sél dina IPR tiasa nyababkeun organisasi has tina baris longitudinal paralel sél épidermal dina internode. Panemuan kami anu dijelaskeun di luhur nunjukkeun yén sinyal GA kamungkinan maénkeun peran dina prosés ieu ku cara ngatur arah divisi sél.
Leungitna fungsi sababaraha gén DELLA nyababkeun réspon GA konstitutif, sareng mutan della tiasa dianggo pikeun nguji hipotesis ieu44. Kami mimiti nganalisis pola éksprési lima gén DELLA dina SAM. Fusi transkripsi tina garis GUS45 ngungkabkeun yén GAI, RGA, RGL1, sareng RGL2 (dina tingkat anu langkung alit) diekspresikeun dina SAM (Gambar Tambahan 11a–d). Hibridisasi in situ salajengna nunjukkeun yén mRNA GAI akumulasi khusus dina primordia sareng kembang anu nuju mekar (Gambar Tambahan 11e). MRNA RGL1 sareng RGL3 dideteksi di sakumna kanopi SAM sareng dina kembang anu langkung lami, sedengkeun mRNA RGL2 langkung seueur di daérah wates (Gambar Tambahan 11f–h). Pencitraan confocal pRGL3::RGL3-GFP SAM mastikeun éksprési anu dititénan ku hibridisasi in situ sareng nunjukkeun yén protéin RGL3 akumulasi di bagian tengah SAM (Gambar Tambahan 11i). Ngagunakeun garis pRGA::GFP-RGA, urang ogé mendakan yén protéin RGA akumulasi dina SAM, tapi jumlahna nurun di wates dimimitian ti P4 (Gambar Tambahan 11j). Anu penting, pola éksprési RGL3 sareng RGA konsisten sareng aktivitas pensinyalan GA anu langkung luhur dina IPR, sakumaha anu dideteksi ku qmRGA (Gambar 4). Leuwih ti éta, data ieu nunjukkeun yén sadaya DELLA diekspresikan dina SAM sareng éksprési na sacara koléktif ngawengku sakumna SAM.
Salajengna, urang nganalisis parameter divisi sél dina SAM tipe liar (Ler, kontrol) sareng mutan gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (global) (Gambar 6a, b). Anu pikaresepeun, urang niténan parobahan anu signifikan sacara statistik dina distribusi frékuénsi sudut divisi sél dina SAM mutan della global dibandingkeun sareng tipe liar (Gambar 6c). Parobihan dina mutan della global ieu disababkeun ku paningkatan frékuénsi sudut 80–90° (34,71% vs 24,55%) sareng, dina tingkat anu langkung alit, sudut 70–80° (23,78% vs 20,18%), nyaéta, saluyu sareng divisi sél transversal (Gambar 6c). Frékuénsi divisi non-transversal (0–60°) ogé langkung handap dina mutan della global (Gambar 6c). Frékuénsi divisi sél transversal ningkat sacara signifikan dina SAM mutan della global (Gambar 6b). Frékuénsi divisi sél transversal dina IPR ogé langkung luhur dina mutan global della dibandingkeun sareng tipe liar (Gambar 6d). Di luar daérah IPR, tipe liar ngagaduhan distribusi sudut divisi sél anu langkung seragam, sedengkeun mutan global della langkung milih divisi tangensial sapertos IPR (Gambar 6e). Kami ogé ngitung orientasi divisi sél dina SAM tina mutan kuintuple ga2 oksidase (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, sareng ga2ox6-2), latar tukang mutan anu teu aktip GA dimana GA akumulasi. Saluyu sareng kanaékan tingkat GA, SAM tina infloresensi mutan quintuple ga2ox langkung ageung tibatan Col-0 (Gambar Tambahan 12a, b), sareng dibandingkeun sareng Col-0, SAM quintuple ga2ox nunjukkeun distribusi sudut divisi sél anu béda pisan, kalayan frékuénsi sudut ningkat ti 50° dugi ka 90°, nyaéta deui-deui langkung milih divisi tangensial (Gambar Tambahan 12a–c). Ku kituna, urang nunjukkeun yén aktivasi konstitutif tina pensinyalan GA sareng akumulasi GA ngainduksi divisi sél lateral dina IPR sareng sésana SAM.
a, b Visualisasi 3D tina lapisan L1 tina Ler (a) anu diwarnaan PI sareng mutan della global (b) SAM nganggo mikroskop confocal. Dinding sél anyar anu kabentuk dina SAM (tapi sanés primordium) salami periode 10 jam dipidangkeun sareng diwarnaan numutkeun nilai sudutna. Sisipan nunjukkeun SAM dina 0 jam. Bilah warna dipidangkeun di pojok katuhu handap. Panah dina (b) nunjuk kana conto file sél anu saluyu dina mutan della global. Ékspérimén ieu diulang dua kali kalayan hasil anu sami. babandingan distribusi frékuénsi orientasi bidang divisi sél dina sakumna SAM (d), IPR (e), sareng non-IPR (f) antara Ler sareng della global. Nilai P diala nganggo tés Kolmogorov-Smirnov dua sisi. f, g Visualisasi 3D tina gambar confocal tina SAM anu diwarnaan PI tina pepelakan transgenik Col-0 (i) sareng pCUC2::gai-1-VENUS (j). Panel (a, b) némbongkeun témbok sél anyar (tapi lain primordia) anu kabentuk dina SAM dina 10 jam. Ékspérimén ieu diulang dua kali kalayan hasil anu sami. h–j Babandingan distribusi frékuénsi orientasi bidang divisi sél anu aya di sakumna SAM (h), IPR (i) sareng non-IPR (j) antara pepelakan Col-0 sareng pCUC2::gai-1-VENUS. Nilai P diala nganggo uji Kolmogorov–Smirnov dua sisi.
Salajengna, urang nguji pangaruh ngahambat sinyal GA khususna dina IP R. Pikeun tujuan ieu, urang nganggo promotor cotyledon cup 2 (CUC2) pikeun ngadorong éksprési protéin gai-1 négatif dominan anu ngahiji sareng VENUS (dina garis pCUC2::gai-1-VENUS). Dina SAM tipe liar, promotor CUC2 ngadorong éksprési kaseueuran IP R dina SAM, kalebet sél wates, ti P4 ka payun, sareng éksprési spésifik anu sami dititénan dina pepelakan pCUC2::gai-1-VENUS (tingali di handap). Distribusi sudut divisi sél di sakuliah SAM atanapi IP R pepelakan pCUC2::gai-1-VENUS henteu béda sacara signifikan sareng tipe liar, sanaos sacara teu disangka-sangka urang mendakan yén sél tanpa IP R dina pepelakan ieu dibagi dina frékuénsi anu langkung luhur 80–90° (Gambar 6f–j).
Geus aya nu ngusulkeun yén arah divisi sél gumantung kana géométri SAM, utamana tegangan tarik anu dihasilkeun ku kelengkungan jaringan46. Ku kituna, urang nanya naha bentuk SAM robah dina mutan global della sareng pepelakan pCUC2::gai-1-VENUS. Sakumaha anu dilaporkeun sateuacanna12, ukuran mutan global della SAM langkung ageung tibatan tipe liar (Gambar Tambahan 13a, b, d). Hibridisasi in situ CLV3 sareng STM RNA mastikeun ékspansi meristem dina mutan della sareng salajengna nunjukkeun ékspansi lateral tina niche sél stém (Gambar Tambahan 13e, f, h, i). Nanging, kelengkungan SAM sami dina duanana genotip (Gambar Tambahan 13k, m, n, p). Urang niténan paningkatan ukuran anu sami dina mutan quadruple gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della tanpa parobahan kelengkungan dibandingkeun sareng tipe liar (Gambar Tambahan 13c, d, g, j, l, o, p). Frékuénsi orientasi divisi sél ogé kapangaruhan dina mutan della quadruple, tapi dina tingkat anu langkung alit tibatan dina mutan della monolitik (Gambar Tambahan 12d–f). Pangaruh dosis ieu, sareng henteuna pangaruh kana kelengkungan, nunjukkeun yén aktivitas RGL3 sésa dina mutan Della quadruple ngawatesan parobahan dina orientasi divisi sél anu disababkeun ku leungitna aktivitas DELLA sareng yén parobahan dina divisi sél lateral lumangsung salaku réspon kana parobahan dina aktivitas sinyal GA tinimbang parobahan dina géométri SAM. Sakumaha anu dijelaskeun di luhur, promotor CUC2 ngadorong éksprési IP R dina SAM dimimitian ti P4 (Gambar Tambahan 14a, b), sareng sabalikna, SAM pCUC2::gai-1-VENUS ngagaduhan ukuran anu langkung alit tapi kelengkungan anu langkung luhur (Gambar Tambahan 14c–h). Parobihan dina morfologi SAM pCUC2::gai-1-VENUS ieu tiasa nyababkeun distribusi setrés mékanis anu béda dibandingkeun sareng jinis liar, dimana setrés sirkumferensial anu luhur dimimitian dina jarak anu langkung pondok ti puseur SAM47. Alternatipna, parobahan dina morfologi pCUC2::gai-1-VENUS SAM tiasa hasil tina parobahan dina sipat mékanis régional anu diinduksi ku éksprési transgén48. Dina dua kasus éta, ieu tiasa ngimbangan sabagian pangaruh parobahan dina sinyal GA ku cara ningkatkeun kamungkinan sél bakal ngabagi dina orientasi sirkumférensial/transversal, anu ngajelaskeun pangamatan urang.
Sacara gembleng, data kami mastikeun yén sinyal GA anu langkung luhur maénkeun peran aktif dina orientasi lateral bidang divisi sél dina IPR. Éta ogé nunjukkeun yén kelengkungan meristem ogé mangaruhan orientasi bidang divisi sél dina IPR.
Orientasi transversal tina bidang divisi dina IPR, kusabab aktivitas sinyal GA anu luhur, nunjukkeun yén GA ngatur file sél radial dina épidermis dina SAM pikeun nangtukeun organisasi sél anu engkéna bakal kapanggih dina internode épidermal. Memang, file sél sapertos kitu sering katingali dina gambar SAM tina mutan della global (Gambar 6b). Ku kituna, pikeun langkung ngajalajah fungsi perkembangan pola spasial sinyal GA dina SAM, kami nganggo pencitraan time-lapse pikeun nganalisis organisasi spasial sél dina IPR dina tipe liar (Ler sareng Col-0), mutan della global, sareng pepelakan transgenik pCUC2::gai-1-VENUS.
Kami mendakan yén qmRGA nunjukkeun yén aktivitas sinyal GA dina IP R ningkat ti P1/P2 sareng ngahontal puncakna dina P4, sareng pola ieu tetep konstan salami waktos (Gambar 4a–f sareng Gambar Tambahan 8c–f, k). Pikeun nganalisis organisasi spasial sél dina IP R kalayan sinyal GA anu ningkat, kami ngalabel sél IP R Ler di luhur sareng ka sisi P4 numutkeun nasib perkembanganana anu dianalisis 34 jam saatos observasi munggaran, nyaéta, langkung ti dua kali plastid, anu ngamungkinkeun kami nuturkeun sél IP R salami perkembangan primordium ti P1/P2 dugi ka P4. Kami nganggo tilu warna anu béda: konéng pikeun sél anu diintegrasikeun kana primordium caket P4, héjo pikeun anu aya dina IP R, sareng wungu pikeun anu milu dina dua prosés (Gambar 7a–c). Dina t0 (0 jam), 1–2 lapisan sél IP R katingali di payuneun P4 (Gambar 7a). Sapertos anu dipiharep, nalika sél ieu dibagi, aranjeunna ngalakukeunana utamina ngalangkungan bidang divisi transversal (Gambar 7a–c). Hasil anu sami diala nganggo Col-0 SAM (fokus kana P3, anu watesna ngalipet sami sareng P4 dina Ler), sanaos dina genotip ieu lipatan anu kabentuk dina wates kembang nyumputkeun sél IPR langkung gancang (Gambar 7g–i). Ku kituna, pola divisi sél IPR ngatur sél kana baris radial, sapertos dina internode. Organisasi baris radial sareng lokalisasi sél IPR antara organ anu padeukeut nunjukkeun yén sél ieu mangrupikeun progenitor internodal.
Di dieu, urang ngembangkeun biosensor sinyal GA ratiometrik, qmRGA, anu ngamungkinkeun pemetaan kuantitatif aktivitas sinyal GA anu dihasilkeun tina konsentrasi reséptor GA sareng GA gabungan bari ngaminimalkeun gangguan kana jalur sinyal éndogén, sahingga nyayogikeun inpormasi ngeunaan fungsi GA dina tingkat sélulér. Pikeun tujuan ieu, urang ngawangun protéin DELLA anu dimodifikasi, mRGA, anu kaleungitan kamampuan pikeun ngabeungkeut mitra interaksi DELLA tapi tetep sénsitip kana protéolisis anu diinduksi GA. qmRGA ngaréspon kana parobahan éksogén sareng éndogén dina tingkat GA, sareng sipat sensing dinamisna ngamungkinkeun penilaian parobahan spatiotemporal dina aktivitas sinyal GA salami pamekaran. qmRGA ogé mangrupikeun alat anu fleksibel pisan sabab tiasa diadaptasi kana jaringan anu béda ku cara ngarobih promotor anu dianggo pikeun éksprési na (upami diperyogikeun), sareng kumargi sifat jalur sinyal GA anu dilestarikan sareng motif PFYRE di sakuliah angiospermae, éta kamungkinan tiasa dialihkeun ka spésiés sanés22. Saluyu sareng ieu, mutasi anu sami dina protéin béas SLR1 DELLA (HYY497AAA) ogé dipidangkeun pikeun ngurangan aktivitas represor pertumbuhan SLR1 bari ngan ukur ngirangan sakedik degradasi anu dimediasi GA, sami sareng mRGA23. Anu penting, panilitian anyar dina Arabidopsis nunjukkeun yén hiji mutasi asam amino dina domain PFYRE (S474L) ngarobih aktivitas transkripsi RGA tanpa mangaruhan kamampuanna pikeun berinteraksi sareng mitra faktor transkripsi50. Sanaos mutasi ieu caket pisan sareng 3 substitusi asam amino anu aya dina mRGA, panilitian kami nunjukkeun yén dua mutasi ieu ngarobih karakteristik DELLA anu béda. Sanaos kalolobaan mitra faktor transkripsi ngabeungkeut kana domain LHR1 sareng SAW tina DELLA26,51, sababaraha asam amino anu dilestarikan dina domain PFYRE tiasa ngabantosan ngastabilkeun interaksi ieu.
Kamekaran internode mangrupikeun sipat konci dina arsitéktur pepelakan sareng paningkatan hasil. qmRGA ngungkabkeun aktivitas sinyal GA anu langkung luhur dina sél progenitor internode IP R. Ku ngagabungkeun pencitraan kuantitatif sareng genetika, kami nunjukkeun yén pola sinyal GA ngalapiskeun bidang divisi sél sirkular/transversal dina épidermis SAM, ngabentuk organisasi divisi sél anu diperyogikeun pikeun kamekaran internode. Sababaraha régulator orientasi bidang divisi sél parantos diidéntifikasi nalika pamekaran52,53. Karya kami nyayogikeun conto anu jelas ngeunaan kumaha aktivitas sinyal GA ngatur parameter sélular ieu. DELLA tiasa berinteraksi sareng kompleks protéin prefolding41, janten sinyal GA tiasa ngatur orientasi bidang divisi sél ku cara langsung mangaruhan orientasi mikrotubulus kortikal40,41,54,55. Kami sacara teu disangka-sangka nunjukkeun yén dina SAM, korélasi aktivitas sinyal GA anu langkung luhur sanés pemanjangan atanapi divisi sél, tapi ngan ukur anisotropi pertumbuhan, anu konsisten sareng pangaruh langsung GA kana arah divisi sél dina IP R. Nanging, urang henteu tiasa ngaluarkeun yén pangaruh ieu ogé tiasa teu langsung, contona dimediasi ku pelembutan témbok sél anu diinduksi GA56. Parobahan dina sipat témbok sél nimbulkeun setrés mékanis57,58, anu ogé tiasa mangaruhan orientasi bidang divisi sél ku cara mangaruhan orientasi mikrotubulus kortikal39,46,59. Pangaruh gabungan tina setrés mékanis anu diinduksi ku GA sareng pangaturan langsung orientasi mikrotubulus ku GA tiasa kalibet dina ngahasilkeun pola khusus orientasi divisi sél dina IPR pikeun ngajelaskeun internode, sareng panilitian salajengna diperyogikeun pikeun nguji ideu ieu. Nya kitu, panilitian sateuacana parantos nyorot pentingna protéin anu berinteraksi sareng DELLA TCP14 sareng 15 dina kontrol formasi internode60,61 sareng faktor-faktor ieu tiasa ngamediasi tindakan GA babarengan sareng BREVIPEDICELLUS (BP) sareng PENNYWISE (PNY), anu ngatur kamekaran internode sareng parantos dipidangkeun mangaruhan sinyal GA2,62. Kusabab DELLA berinteraksi sareng jalur sinyal brassinosteroid, etilena, asam jasmonat, sareng asam absisat (ABA)63,64 sareng hormon ieu tiasa mangaruhan orientasi mikrotubulus65, pangaruh GA kana orientasi divisi sél ogé tiasa dimediasi ku hormon sanés.
Panilitian sitologis awal nunjukkeun yén daérah jero sareng luar SAM Arabidopsis diperyogikeun pikeun kamekaran internode2,42. Kanyataan yén GA sacara aktif ngatur divisi sél dina jaringan jero12 ngadukung fungsi ganda GA dina ngatur ukuran meristem sareng internode dina SAM. Pola divisi sél arah ogé diatur pageuh dina jaringan SAM jero, sareng pangaturan ieu penting pikeun kamekaran batang52. Bakal pikaresepeun pikeun nalungtik naha GA ogé maénkeun peran dina orientasi bidang divisi sél dina organisasi SAM jero, ku kituna sinkronisasi spésifikasi sareng kamekaran internode dina SAM.
Tutuwuhan dipelak sacara in vitro dina taneuh atanapi 1x média Murashige-Skoog (MS) (Duchefa) anu ditambahan ku 1% sukrosa sareng 1% agar (Sigma) dina kaayaan standar (cahaya 16 jam, 22 °C), kecuali pikeun ékspérimén hipokotil sareng kamekaran akar dimana bibit dipelak dina pelat vertikal dina cahaya konstan sareng 22 °C. Pikeun ékspérimén nitrat, pepelakan dipelak dina média MS anu dimodifikasi (médium tutuwuhan bioWORLD) anu ditambahan ku nitrat anu nyukupan (0 atanapi 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-suksinat, 1% sukrosa sareng 1% A-agar (Sigma) dina kaayaan beurang panjang.
cDNA GID1a anu diasupkeun kana pDONR221 digabungkeun deui sareng pDONR P4-P1R-pUBQ10 sareng pDONR P2R-P3-mCherry kana pB7m34GW pikeun ngahasilkeun pUBQ10::GID1a-mCherry. DNA IDD2 anu diasupkeun kana pDONR221 digabungkeun deui kana pB7RWG266 pikeun ngahasilkeun p35S:IDD2-RFP. Pikeun ngahasilkeun pGID1b::2xmTQ2-GID1b, fragmen 3,9 kb di hulu daérah kode GID1b sareng fragmen 4,7 kb anu ngandung cDNA GID1b (1,3 kb) sareng terminator (3,4 kb) mimitina diamplifikasi nganggo primer dina Tabel Tambahan 3 teras diasupkeun kana pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) sareng pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), masing-masing, sareng pamustunganana digabungkeun deui sareng pDONR221 2xmTQ268 kana vektor target pGreen 012567 nganggo kloning Gateway. Pikeun ngahasilkeun pCUC2::LSSmOrange, runtuyan promotor CUC2 (3229 bp di hulu ATG) dituturkeun ku runtuyan kodeu mOrange anu digeser Stokes ageung (LSSmOrange)69 kalayan sinyal lokalisasi nuklir N7 sareng terminator transkripsi NOS dirakit kana vektor targeting kanamycin pGreen nganggo sistem rekombinasi fragmen Gateway 3 (Invitrogen). Vektor binér pepelakan diwanohkeun kana galur Agrobacterium tumefaciens GV3101 sareng diwanohkeun kana daun Nicotiana benthamiana ku metode infiltrasi Agrobacterium sareng kana Arabidopsis thaliana Col-0 ku metode celup kembang, masing-masing. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry sareng pCLV3::mCherry-NLS qmRGA diisolasi tina turunan F3 sareng F1 tina persilangan masing-masing.
Hibridisasi in situ RNA dilaksanakeun dina pucuk pucuk anu panjangna kira-kira 1 cm72, anu dikumpulkeun sareng langsung difiksasi dina larutan FAA (3,7% formaldehida, 5% asam asetat, 50% étanol) anu didinginkan dugi ka 4 °C. Saatos perlakuan vakum 2 × 15 menit, fiksatif diganti sareng sampel diinkubasi sapeuting. cDNA GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, sareng RGL3 sareng probe antisense kana 3′-UTR na disintésis nganggo primer anu dipidangkeun dina Tabel Tambahan 3 sapertos anu dijelaskeun ku Rosier et al.73. Probe anu dilabélan digoxigenin dideteksi sacara imun nganggo antibodi digoxigenin (pangenceran 3000 kali lipat; Roche, nomer katalog: 11 093 274 910), sareng bagian-bagianna diwarnaan ku larutan 5-bromo-4-kloro-3-indolil fosfat (BCIP, pangenceran 250 kali lipat)/nitroblue tetrazolium (NBT, pangenceran 200 kali lipat).
Waktos posting: 10-Peb-2025