Nematoda pinus nyaéta endoparasit migrasi karantina anu dipikanyaho nyababkeun karugian ékonomi anu parah dina ékosistem leuweung pinus. Panilitian ieu marios aktivitas nematisida indol halogenasi ngalawan nematoda pinus sareng mékanisme aksina. Aktivitas nematisida 5-iodoindole sareng avermectin (kontrol positif) ngalawan nematoda pinus sami sareng luhur dina konsentrasi anu handap (10 μg/mL). 5-iodoindole ngirangan fekunditas, aktivitas réproduktif, mortalitas embrio sareng larva, sareng paripolah lokomotor. Interaksi molekuler ligan sareng reséptor saluran klorida anu digégél glutamat khusus invertebrata ngadukung anggapan yén 5-iodoindole, sapertos avermectin, ngabeungkeut pageuh kana situs aktif reséptor. 5-Iodoindole ogé ngainduksi rupa-rupa deformasi fenotipik dina nematoda, kalebet runtuhna/susut organ anu teu normal sareng ningkatna vakuolisasi. Hasil ieu nunjukkeun yén vakuola tiasa maénkeun peran dina maot anu dimediasi métilasi nematoda. Anu penting, 5-iodoindole henteu toksik pikeun spésiés pepelakan (kol sareng lobak). Ku kituna, panilitian ieu nunjukkeun yén aplikasi iodoindole dina kaayaan lingkungan tiasa ngontrol karusakan layu pinus.
Nematoda kai pinus (Bursaphelenchus xylophilus) kagolong kana nematoda kai pinus (PWN), nematoda endoparasit migrasi anu dipikanyaho nyababkeun karusakan ékologis anu parah kana ékosistem leuweung pinus1. Panyakit layu pinus (PWD) anu disababkeun ku nematoda kai pinus janten masalah serius di sababaraha buana, kalebet Asia sareng Éropa, sareng di Amérika Kalér, nematoda ngancurkeun spésiés pinus anu diwanohkeun1,2. Turunna tangkal pinus mangrupikeun masalah ékonomi utama, sareng prospek panyebaran globalna pikahariwangeun3. Spésiés pinus ieu anu paling sering diserang ku nematoda: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii, sareng Pinus radiata4. Nematoda pinus mangrupikeun panyakit serius anu tiasa maéhan tangkal pinus dina sababaraha minggu atanapi bulan saatos inféksi. Salaku tambahan, wabah nematoda pinus umum di rupa-rupa ékosistem, janten ranté inféksi anu terus-terusan parantos ditetepkeun1.
Bursaphelenchus xylophilus nyaéta nematoda parasit tutuwuhan karantina anu kagolong kana superfamili Aphelenchoidea sareng clade 102.5. Nematoda ieu ngahakan jamur sareng baranahan dina jaringan kai tangkal pinus, berkembang jadi opat tahapan larva anu béda: L1, L2, L3, L4 sareng individu déwasa1,6. Dina kaayaan kakurangan dahareun, nematoda pinus ngaliwat kana tahapan larva khusus - dauer, anu ngaparasitisasi vektorna - kumbang kulit pinus (Monochamus alternatus) sareng ditransfer ka tangkal pinus anu séhat. Dina inang anu séhat, nematoda gancang migrasi ngaliwatan jaringan tutuwuhan sareng ngahakan sél parenkim, anu nyababkeun sababaraha réaksi hipersensitivitas, layu pinus sareng maot dina sataun saatos inféksi1,7,8.
Pangendalian biologis nematoda pinus parantos lami janten tantangan, kalayan tindakan karantina anu dimimitian ti abad ka-20. Strategi ayeuna pikeun ngontrol nematoda pinus utamina ngalibatkeun perlakuan kimia, kalebet fumigasi kai sareng implantasi nematisida kana batang tangkal. Nematisida anu paling umum dianggo nyaéta avermectin sareng avermectin benzoat, anu kagolong kana kulawarga avermectin. Bahan kimia anu mahal ieu épéktip pisan ngalawan seueur spésiés nematoda sareng dianggap aman pikeun lingkungan9. Nanging, panggunaan nematisida ieu anu diulang-ulang diperkirakeun bakal nyiptakeun tekanan seleksi anu ampir pasti bakal nyababkeun munculna nematoda pinus anu tahan, sapertos anu parantos dipidangkeun pikeun sababaraha hama serangga, sapertos Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella sareng nematoda Trichostrongylus colubriformis sareng Ostertagia circumcincta, anu laun-laun ngembangkeun résistansi kana avermectin10,11,12. Ku alatan éta, pola résistansi kedah dikaji sacara rutin sareng nematisida disaring sacara terus-terusan pikeun mendakan alternatif, efektif biaya sareng ramah lingkungan pikeun ngontrol PVD. Dina sababaraha dasawarsa ka pengker, sababaraha pangarang parantos ngusulkeun panggunaan ekstrak tutuwuhan, minyak atsiri sareng bahan volatil salaku agén pangendali nematoda13,14,15,16.
Kami nembe nunjukkeun aktivitas nematisida indol, molekul sinyal antar sél sareng antar karajaan, dina Caenorhabditis elegans 17. Indole mangrupikeun sinyal intraseluler anu nyebar dina ékologi mikroba, ngontrol sababaraha fungsi anu mangaruhan fisiologi mikroba, formasi spora, stabilitas plasmid, résistansi ubar, formasi biofilm, sareng virulénsi 18, 19. Aktivitas indol sareng turunanana ngalawan nematoda patogén sanésna teu acan ditalungtik. Dina panilitian ieu, kami nalungtik aktivitas nematisida 34 indol ngalawan nematoda pinus sareng ngajelaskeun mékanisme aksi 5-iodoindole anu paling kuat nganggo mikroskop, fotografi time-lapse, sareng ékspérimén docking molekuler, sareng meunteun pangaruh toksikna kana pepelakan nganggo uji pengecambahan siki.
Konsentrasi indol anu luhur (>1,0 mM) sateuacanna parantos dilaporkeun gaduh pangaruh nematisida kana nematoda17. Saatos perlakuan B. xylophilus (tahap kahirupan campuran) nganggo indol atanapi 33 turunan indol anu béda dina 1 mM, mortalitas B. xylophilus diukur ku cara ngitung nematoda hirup sareng paéh dina kelompok kontrol sareng kelompok anu dirawat. Lima indol nunjukkeun aktivitas nematisida anu signifikan; salametna kelompok kontrol anu teu dirawat nyaéta 95 ± 7% saatos 24 jam. Tina 34 indol anu diuji, 5-iodoindole sareng 4-fluoroindole dina 1 mM nyababkeun mortalitas 100%, sedengkeun 5,6-difluoroindigo, metilindole-7-karboksilat, sareng 7-iodoindole nyababkeun mortalitas sakitar 50% (Tabel 1).
Pangaruh 5-iodoindole kana formasi vakuola sareng métabolisme nematoda kai pinus. (A) Pangaruh avermectin sareng 5-iodoindole kana nematoda jalu déwasa, (B) endog nematoda tahap L1 sareng (C) métabolisme B. xylophilus, (i) vakuola henteu katingali dina jam 0, perlakuan ngahasilkeun (ii) vakuola, (iii) akumulasi sababaraha vakuola, (iv) bareuh vakuola, (v) fusi vakuola sareng (vi) formasi vakuola raksasa. Panah beureum nunjukkeun bareuh vakuola, panah biru nunjukkeun fusi vakuola sareng panah hideung nunjukkeun vakuola raksasa. Bilah skala = 50 μm.
Salian ti éta, panilitian ieu ogé ngajelaskeun prosés sekuensial tina maot anu diinduksi ku métana dina nematoda pinus (Gambar 4C). Maot métanogénik nyaéta jinis maot sél non-apoptosis anu aya hubunganana sareng akumulasi vakuola sitoplasma anu nonjol27. Cacad morfologis anu dititénan dina nematoda pinus sigana aya hubunganana raket sareng mékanisme maot anu diinduksi ku métana. Pamariksaan mikroskopis dina waktos anu béda nunjukkeun yén vakuola raksasa kabentuk saatos 20 jam paparan 5-iodoindole (0,1 mM). Vakuola mikroskopis dititénan saatos 8 jam perlakuan, sareng jumlahna ningkat saatos 12 jam. Sababaraha vakuola ageung dititénan saatos 14 jam. Sababaraha vakuola anu ngahiji katingali jelas saatos 12-16 jam perlakuan, nunjukkeun yén fusi vakuola mangrupikeun dasar mékanisme maot métanogénik. Saatos 20 jam, sababaraha vakuola raksasa kapanggih di sakumna cacing. Observasi ieu ngagambarkeun laporan munggaran ngeunaan metuosis dina C. elegans.
Dina cacing anu dirawat 5-iodoindole, agregasi sareng pecahna vakuola ogé katingali (Gambar 5), sakumaha dibuktikeun ku lengkungan cacing sareng pelepasan vakuola kana lingkungan. Gangguan vakuola ogé katingali dina mémbran cangkang endog, anu biasana dijaga utuh ku L2 nalika megar (Gambar Tambahan S2). Observasi ieu ngadukung kalibetna akumulasi cairan sareng kagagalan osmoregulasi, ogé tatu sél anu tiasa dibalikkeun (RCI), dina prosés formasi vakuola sareng supurasi (Gambar 5).
Ngadamel hipotesis ngeunaan peran yodium dina formasi vakuola anu dititénan, urang nalungtik aktivitas nematisida natrium iodida (NaI) sareng kalium iodida (KI). Nanging, dina konsentrasi (0,1, 0,5 atanapi 1 mM), éta henteu mangaruhan boh salametna nematoda atanapi formasi vakuola (Gambar Tambahan S5), sanaos 1 mM KI ngagaduhan pangaruh nematisida anu sakedik. Di sisi anu sanés, 7-iodoindole (1 atanapi 2 mM), sapertos 5-iodoindole, ngainduksi sababaraha vakuola sareng deformasi struktural (Gambar Tambahan S6). Dua iodoindole nunjukkeun ciri fenotipik anu sami dina nematoda pinus, sedengkeun NaI sareng KI henteu. Anu pikaresepeun, indol henteu ngainduksi formasi vakuola dina B. xylophilus dina konsentrasi anu diuji (data henteu dipidangkeun). Ku kituna, hasilna mastikeun yén kompleks indole-iodin tanggung jawab pikeun vakuolisasi sareng métabolisme B. xylophilus.
Di antara indol anu diuji pikeun aktivitas nematisida, 5-iodoindole ngagaduhan indéks slip pangluhurna nyaéta -5,89 kkal/mol, dituturkeun ku 7-iodoindole (-4,48 kkal/mol), 4-fluoroindole (-4,33), sareng indol (-4,03) (Gambar 6). Ikatan hidrogén tulang tonggong anu kuat tina 5-iodoindole ka leusin 218 ngastabilkeun pangiketna, sedengkeun sadaya turunan indol anu sanés ngaiket kana serin 260 ngalangkungan beungkeut hidrogén ranté samping. Di antara iodoindole anu dimodelkeun anu sanés, 2-iodoindole ngagaduhan nilai pangiket -5,248 kkal/mol, anu disababkeun ku beungkeut hidrogén utama na sareng leusin 218. Pangiket anu sanés anu dipikanyaho kalebet 3-iodoindole (-4,3 kkal/mol), 4-iodoindole (-4,0 kkal/mol), sareng 6-fluoroindole (-2,6 kkal/mol) (Gambar Tambahan S8). Kaseueuran indol anu terhalogenasi sareng indol éta sorangan, iwal ti 5-iodoindole sareng 2-iodoindole, ngabentuk beungkeut sareng serin 260. Kanyataan yén beungkeutan hidrogén sareng leusin 218 nunjukkeun beungkeutan reséptor-ligan anu efisien, sapertos anu dititénan pikeun ivermectin (Gambar Tambahan S7), mastikeun yén 5-iodoindole sareng 2-iodoindole, sapertos ivermectin, ngabeungkeut pageuh kana situs aktif reséptor GluCL via leusin 218 (Gambar 6 sareng Gambar Tambahan S8). Kami ngajukeun yén beungkeutan ieu diperyogikeun pikeun ngajaga struktur pori kabuka tina kompleks GluCL sareng ku cara ngabeungkeut pageuh kana situs aktif reséptor GluCL, 5-iodoindole, 2-iodoindole, avermectin sareng ivermectin ngajaga saluran ion kabuka sareng ngamungkinkeun panyerepan cairan.
Docking molekular indol sareng indol terhalogenasi ka GluCL. Orientasi beungkeutan ligan (A) indol, (B) 4-fluoroindole, (C) 7-iodoindole, sareng (D) 5-iodoindole kana situs aktif GluCL. Protéin digambarkeun ku pita, sareng beungkeut hidrogén tulang tonggong dipidangkeun salaku garis putus-putus konéng. (A′), (B′), (C′), sareng (D′) nunjukkeun interaksi ligan anu saluyu sareng résidu asam amino di sakurilingna, sareng beungkeut hidrogén ranté sisi dituduhkeun ku panah putus-putus pink.
Ékspérimén dilakukeun pikeun meunteun pangaruh toksik 5-iodoindole kana pengecambahan siki kol sareng lobak. 5-iodoindole (0,05 atanapi 0,1 mM) atanapi avermectin (10 μg/mL) saeutik pisan pangaruhna kana pengecambahan awal sareng munculna plantlet (Gambar 7). Salian ti éta, teu aya béda anu signifikan anu kapanggih antara laju pengecambahan kontrol anu teu diubaran sareng siki anu diubaran ku 5-iodoindole atanapi avermectin. Pangaruh kana pemanjangan akar tunggang sareng jumlah akar lateral anu kabentuk teu signifikan, sanaos 1 mM (10 kali konsentrasi aktifna) tina 5-iodoindole rada ngalambatkeun kamekaran akar lateral. Hasil ieu nunjukkeun yén 5-iodoindole henteu toksik pikeun sél pepelakan sareng henteu ngaganggu prosés kamekaran pepelakan dina konsentrasi anu ditalungtik.
Pangaruh 5-iodoindole kana pengecambahan siki. Perkecambahan, bertunas, sareng perakaran lateral siki B. oleracea sareng R. raphanistrum dina média agar Murashige sareng Skoog nganggo atanapi tanpa avermectin atanapi 5-iodoindole. Perkecambahan kacatet saatos 3 dinten inkubasi dina suhu 22°C.
Panilitian ieu ngalaporkeun sababaraha kasus pembunuhan nematoda ku indol. Anu penting, ieu mangrupikeun laporan munggaran ngeunaan metilasi anu diinduksi ku iodoindole (prosés anu disababkeun ku akumulasi vakuola leutik anu laun-laun ngahiji jadi vakuola raksasa, anu pamustunganana nyababkeun pecahna mémbran sareng maot) dina jarum pinus, kalayan iodoindole nunjukkeun sipat nematisida anu signifikan sami sareng nematisida komérsial avermectin.
Indol sateuacanna parantos dilaporkeun ngalaksanakeun sababaraha fungsi sinyal dina prokariot sareng eukariot, kalebet inhibisi/formasi biofilm, survival baktéri, sareng patogenisitas19,32,33,34. Anyar-anyar ieu, épék terapi poténsial tina indol halogenasi, alkaloid indol, sareng turunan indol semisintétik parantos narik minat panalungtikan anu éksténsif35,36,37. Salaku conto, indol halogenasi parantos dipidangkeun pikeun maéhan sél Escherichia coli sareng Staphylococcus aureus anu terus-terusan37. Salaku tambahan, éta mangrupikeun minat ilmiah pikeun nalungtik khasiat indol halogenasi ngalawan spésiés, genera, sareng karajaan sanés, sareng panilitian ieu mangrupikeun léngkah pikeun ngahontal tujuan ieu.
Di dieu, urang ngajukeun mékanisme pikeun lethality anu diinduksi ku 5-iodoindole dina C. elegans dumasar kana tatu sél anu tiasa dibalikkeun (RCI) sareng metilasi (Gambar 4C sareng 5). Parobahan edematous sapertos bareuh sareng degenerasi vakuolar mangrupikeun indikator RCI sareng metilasi, anu diwujudkeun salaku vakuola raksasa dina sitoplasma48,49. RCI ngaganggu produksi énergi ku cara ngirangan produksi ATP, nyababkeun kagagalan pompa ATPase, atanapi ngaganggu mémbran sél sareng nyababkeun asupan Na+, Ca2+, sareng cai anu gancang50,51,52. Vakuola intrasitoplasma timbul dina sél sato salaku hasil tina akumulasi cairan dina sitoplasma kusabab asupan Ca2+ sareng cai53. Anu pikaresepeun, mékanisme karusakan sél ieu tiasa dibalikkeun upami karusakan éta samentawis sareng sél mimiti ngahasilkeun ATP salami periode waktu anu tangtu, tapi upami karusakan éta teras-terasan atanapi parah, sél-sél éta maot.54 Panemuan urang nunjukkeun yén nematoda anu dirawat ku 5-iodoindole henteu tiasa mulangkeun biosintésis normal saatos kakeunaan kaayaan setrés.
Fenotipe metilasi anu diinduksi ku 5-iodoindole dina B. xylophilus tiasa disababkeun ku ayana yodium sareng distribusi molekulna, kumargi 7-iodoindole ngagaduhan pangaruh inhibisi anu langkung alit dina B. xylophilus tibatan 5-iodoindole (Tabel 1 sareng Gambar Tambahan S6). Hasil ieu sabagian konsisten sareng panilitian Maltese et al. (2014), anu ngalaporkeun yén translokasi gugus nitrogén piridil dina indol tina posisi para- ka meta- ngaleungitkeun vakuolisasi, inhibisi pertumbuhan, sareng sitotoksisitas dina sél U251, nunjukkeun yén interaksi molekul sareng situs aktif khusus dina protéin penting pisan27,44,45. Interaksi antara indol atanapi indol terhalogenasi sareng reséptor GluCL anu dititénan dina panilitian ieu ogé ngadukung gagasan ieu, sabab 5- sareng 2-iodoindole kapendak ngabeungkeut reséptor GluCL langkung kuat tibatan indol sanés anu ditalungtik (Gambar 6 sareng Gambar Tambahan S8). Yodium dina posisi kadua atanapi kalima indol kapanggih ngabeungkeut leusin 218 tina reséptor GluCL ngalangkungan beungkeut hidrogén tulang tonggong, sedengkeun indol halogenasi anu sanés sareng indol sorangan ngabentuk beungkeut hidrogén ranté sisi anu lemah sareng serin 260 (Gambar 6). Ku kituna kami ngaduga yén lokalisasi halogen maénkeun peran penting dina induksi degenerasi vakuolar, sedengkeun beungkeutan 5-iodoindole anu pageuh ngajaga saluran ion tetep kabuka, sahingga ngamungkinkeun aliran cairan anu gancang sareng pecahna vakuola. Nanging, mékanisme aksi 5-iodoindole anu lengkep masih kedah ditangtukeun.
Sateuacan aplikasi praktis 5-iodoindole, pangaruh toksikna kana pepelakan kedah dianalisis. Ékspérimén pengecambahan siki kami nunjukkeun yén 5-iodoindole henteu gaduh pangaruh négatif kana pengecambahan siki atanapi prosés kamekaran salajengna dina konsentrasi anu ditalungtik (Gambar 7). Ku kituna, panilitian ieu nyayogikeun dasar pikeun panggunaan 5-iodoindole dina lingkungan ékologis pikeun ngontrol bahaya nématoda pinus ka tangkal pinus.
Laporan-laporan samemehna parantos nunjukkeun yén terapi berbasis indol mangrupikeun pendekatan poténsial pikeun ngungkulan masalah résistansi antibiotik sareng kamajuan kanker55. Salian ti éta, indol ngagaduhan aktivitas antibakteri, antikanker, antioksidan, anti radang, antidiabetes, antivirus, antiproliferatif sareng antituberkulosis sareng tiasa janten dasar anu ngajangjikeun pikeun pamekaran ubar56,57. Panilitian ieu nunjukkeun pikeun kahiji kalina poténsi panggunaan yodium salaku agén antiparasit sareng anthelmintik.
Avermectin kapanggih tilu dekade ka tukang sareng meunang Hadiah Nobel dina taun 2015, sareng panggunaanana salaku anthelmintik masih aktip lumangsung. Nanging, kusabab kamekaran résistansi anu gancang kana avermectin dina nematoda sareng hama serangga, strategi alternatif, murah, sareng ramah lingkungan diperyogikeun pikeun ngontrol inféksi PWN dina tangkal pinus. Panilitian ieu ogé ngalaporkeun mékanisme 5-iodoindole maéhan nematoda pinus sareng 5-iodoindole gaduh toksisitas anu handap pikeun sél pepelakan, anu muka prospek anu saé pikeun aplikasi komérsialna ka hareup.
Sadaya ékspérimén parantos disatujuan ku Komite Étika Universitas Yeungnam, Gyeongsan, Koréa, sareng metode-metode éta dilaksanakeun saluyu sareng pedoman Komite Étika Universitas Yeungnam.
Ékspérimén inkubasi endog dilaksanakeun nganggo prosedur anu tos ditetepkeun43. Pikeun meunteun laju megar (HR), nematoda déwasa umur 1 dinten (sakitar 100 bikang sareng 100 jalu) dipindahkeun kana cawan Petri anu ngandung jamur sareng diidinan tumuh salami 24 jam. Endog teras diisolasi sareng dirawat ku 5-iodoindole (0,05 mM sareng 0,1 mM) atanapi avermectin (10 μg/ml) salaku suspénsi dina cai sulingan steril. Suspénsi ieu (500 μl; sakitar 100 endog) dipindahkeun kana sumur piring kultur jaringan 24-sumur sareng diinkubasi dina suhu 22 °C. Itungan L2 dilakukeun saatos 24 jam inkubasi tapi dianggap paéh upami sél henteu gerak nalika dirangsang ku kawat platinum anu saé. Ékspérimén ieu dilaksanakeun dina dua tahapan, masing-masing kalayan genep pangulangan. Data tina dua ékspérimén digabungkeun sareng dipidangkeun. Perséntase HR diitung sapertos kieu:
Mortalitas larva ditaksir nganggo prosedur anu parantos dikembangkeun sateuacanna. Endog nematoda dikumpulkeun sareng embrio disinkronkeun ku cara megar dina cai sulingan steril pikeun ngahasilkeun larva tahap L2. Larva anu disinkronkeun (sakitar 500 nematoda) dirawat ku 5-iodoindole (0,05 mM sareng 0,1 mM) atanapi avermectin (10 μg/ml) sareng dipiara dina pelat Petri B. cinerea. Saatos 48 jam inkubasi dina suhu 22 °C, nematoda dikumpulkeun dina cai sulingan steril sareng dipariksa pikeun ayana tahap L2, L3, sareng L4. Ayana tahap L3 sareng L4 nunjukkeun transformasi larva, sedengkeun ayana tahap L2 nunjukkeun henteu aya transformasi. Gambar diala nganggo Sistem Pencitraan Sel Digital iRiS™. Ékspérimén ieu dilaksanakeun dina dua tahapan, masing-masing kalayan genep pangulangan. Data tina dua ékspérimén digabungkeun sareng dipidangkeun.
Toksisitas 5-iodoindole sareng avermectin kana siki dipeunteun nganggo uji pengecambahan dina piring agar Murashige sareng Skoog.62 Siki B. oleracea sareng R. raphanistrum mimitina direndem dina cai sulingan steril salami sadinten, dikumbah ku 1 ml étanol 100%, disterilisasi ku 1 ml pemutih komérsial 50% (3% natrium hipoklorit) salami 15 menit, sareng dikumbah lima kali ku 1 ml cai steril. Siki anu disterilisasi teras dipencet kana piring agar pengecambahan anu ngandung 0,86 g/l (0,2X) média Murashige sareng Skoog sareng 0,7% agar bakteriologis nganggo atanapi tanpa 5-iodoindole atanapi avermectin. Piring teras diinkubasi dina suhu 22 °C, sareng gambar dicandak saatos 3 dinten inkubasi. Ékspérimén ieu dilaksanakeun dina dua tahapan, anu masing-masing ngagaduhan genep pangulangan.
Waktos posting: 26-Peb-2025