Hatur nuhun pikeun ngadatangan Nature.com.Versi browser anu anjeun anggo gaduh dukungan CSS kawates.Pikeun hasil nu pangsaena, kami nyarankeun Anjeun make versi anyar tina panyungsi anjeun (atawa nonaktipkeun Mode kasaluyuan dina Internet Explorer).Samentara éta, pikeun mastikeun rojongan lumangsung, kami némbongkeun situs tanpa styling atanapi JavaScript.
Papanggihan sareng mangpaat produk alam tiasa ngabantosan ningkatkeun kahirupan manusa.Bahan kimia ngahambat pertumbuhan tutuwuhan loba dipaké salaku herbisida pikeun ngadalikeun weeds.Alatan kabutuhan ngagunakeun rupa-rupa herbisida, aya kabutuhan pikeun ngaidentipikasi sanyawa sareng mékanisme aksi anu anyar.Dina ulikan ieu, urang manggihan novél N -alkoxypyrrole sanyawa, coumamonamide, ti Streptomyces werraensis MK493-CF1 sarta ngadegkeun prosés sintésis lengkep.Ngaliwatan assays aktivitas biologis, urang manggihan yén asam urs-monoamic mangrupakeun perantara sintétik urs-monoamide sarta poténsial.inhibitor pertumbuhan tutuwuhan.Salaku tambahan, kami parantos ngembangkeun rupa-rupa turunan asam urbenonik, kalebet turunan urbenyloxy (UDA), anu ngagaduhan kagiatan herbisida anu luhur tanpa mangaruhan négatip kana kamekaran sél HeLa.Urang ogé manggihan yén turunan asam urmotonic ngaganggu mikrotubulus tutuwuhan;Sajaba ti éta, KAND mangaruhan filamén aktin sarta induces maot sél;Épék multifaceted ieu béda ti sambetan microtubule anu dipikanyaho sareng nyarankeun mékanisme aksi anyar pikeun asam ursonic, anu ngagambarkeun kaunggulan penting dina pamekaran herbisida anyar.
Penemuan sareng aplikasi praktis produk alam anu mangpaat sareng turunanna mangrupikeun sarana pikeun ningkatkeun kualitas kahirupan manusa.Métabolit sékundér anu dihasilkeun ku mikroorganisme, pepelakan sareng serangga parantos nyababkeun kamajuan utama dina ubar sareng tatanén.Loba antibiotik jeung ubar anti leukemia geus dimekarkeun tina produk alam.Sajaba ti éta, rupa-rupa jenispéstisida, fungisida sareng herbisida diekstrak tina produk alami ieu pikeun dianggo dina tatanén.Khususna, herbisida kontrol jukut mangrupikeun alat anu penting pikeun ningkatkeun hasil pepelakan dina tatanén modéren, sareng sababaraha jinis sanyawa parantos dianggo sacara komersil.Sababaraha prosés sélular dina tutuwuhan, kayaning fotosintésis, métabolisme asam amino, sintésis témbok sél, régulasi mitosis, phytohormone signalling, atawa sintésis protéin, dianggap target has herbisida.Sanyawa nu ngahambat fungsi mikrotubulus mangrupakeun kelas umum herbisida nu mangaruhan tumuwuhna tutuwuhan ku mangaruhan régulasi mitosis2.
Mikrotubulus mangrupakeun komponén sitoskeleton sarta loba dilestarikan dina sél eukariot.Heterodimer tubulin diwangun ku α-tubulin sareng β-tubulin ngabentuk protofilamén mikrotubulus linier, kalayan 13 protofilamén ngabentuk struktur silinder.Mikrotubulus maénkeun sababaraha peran dina sél tutuwuhan, kaasup nangtukeun bentuk sél, division sél, jeung transpor intrasélular3,4.Sél tutuwuhan ngandung mikrotubulus handapeun mémbran plasma interphase, sarta disebut mikrotubulus cortical ieu diduga ngadalikeun organisasi microfibrils selulosa ngaliwatan pangaturan kompléx sintase selulosa4,5.Mikrotubulus kortikal sél épidermis akar, aya dina zona elongasi gancang tina ujung akar, ayana sacara lateral, sareng microfibers selulosa nuturkeun mikrotubulus ieu sareng ngawatesan arah ékspansi sél, ku kituna ngamajukeun elongasi sél anisotropik.Ku kituna, fungsi mikrotubulus raket patalina jeung morfologi tutuwuhan.Substitusi asam amino dina gén encoding tubulin ngabalukarkeun skew of cortical microtubule arrays sarta pertumbuhan kénca- atawa katuhu-sided di Arabidopsis 6,7.Nya kitu, mutasi dina protéin microtubule-pakait nu ngatur dinamika microtubule ogé bisa ngakibatkeun growths akar menyimpang8,9,10,11,12,13.Sajaba ti éta, perlakuan jeung microtubule-disrupting herbisida kayaning disopyramide, ogé katelah pretilachlor, ogé ngabalukarkeun tumuwuhna akar serong-kénca sided14.Data ieu nunjukkeun yén pangaturan anu tepat pikeun fungsi mikrotubulus penting pisan pikeun nangtukeun arah kamekaran pepelakan.
Rupa-rupa sambetan mikrotubulus geus kapanggih, sarta ubar ieu geus nyieun kontribusi signifikan pikeun panalungtikan cytoskeletal, kitu ogé pikeun tatanén jeung ubar2.Khususna, oryzalin, sanyawa dinitroaniline, disopyramide, sanyawa anu aya hubunganana sareng bénzamide, sareng analogna tiasa ngahambat fungsi mikrotubulus sareng ku kituna ngahambat kamekaran pepelakan.Ku alatan éta, aranjeunna loba dipaké salaku herbisida.Tapi, kumargi mikrotubulus mangrupikeun komponén penting sél tutuwuhan sareng sasatoan, kalolobaan sambetan mikrotubulus sitotoksik pikeun kadua jinis sél.Ku alatan éta, sanajan utilitas maranéhanana dipikawanoh salaku herbisida, jumlah kawates agén antimicrotubule dipaké pikeun kaperluan praktis.
Streptomyces nyaéta genus ti kulawarga Streptomyces, nu ngawengku baktéri aérobik, gram-positip, filamén sarta dipikawanoh lega alatan kamampuhna pikeun ngahasilkeun rupa-rupa métabolit sekundér.Ku alatan éta, éta dianggap salah sahiji sumber pangpentingna produk alam biologis aktip anyar.Dina ulikan ayeuna, urang manggihan sanyawa anyar disebut coumamonamide, nu ieu diisolasi tina Streptomyces werraensis MK493-CF1 jeung S. werraensis ISP 5486. Ngagunakeun analisis spéktral jeung analisis spéktral pinuh, struktur coumamonamide ieu dicirikeun jeung Rorongkong N-alkoxypyrrole unik na. ieu ditangtukeun.sintésis.Asam Ursmonic, perantara sintétik tina ursmonoamide sareng turunanna, kapanggih ngahambat tumuwuhna sareng pengecambahan tutuwuhan modél populér Arabidopsis thaliana.Dina ulikan hubungan struktur-aktivitas, urang manggihan yén sanyawa jeung C9 dirobah jadi asam ursonic, disebutna nonyloxy turunan asam ursonic (KAND), nyata ngaronjatkeun pangaruh inhibitory on tumuwuh sarta pengecambahan.Utamana, inhibitor pertumbuhan tutuwuhan nu anyar kapanggih ogé mangaruhan tumuwuhna bako jeung liverwort sarta henteu sitotoksik kana baktéri atawa sél HeLa.Leuwih ti éta, sababaraha turunan asam urmotonat nyababkeun fénotip akar anu menyimpang, nunjukkeun yén turunan ieu langsung atanapi henteu langsung mangaruhan mikrotubulus.Saluyu jeung gagasan ieu, observasi kami ngeunaan microtubulus dilabélan boh immunohistochemically atawa jeung protéin fluoresensi nunjukkeun yén perlakuan KAND depolymerizes microtubules.Salaku tambahan, perlakuan sareng turunan asam kumamotonat ngaganggu mikrofilamén aktin.Ku kituna, urang geus manggihan hiji inhibitor pertumbuhan tutuwuhan anyar nu mékanisme unik tina aksi ngalibatkeun karuksakan sitoskeleton.
Galur MK493-CF1 diisolasi tina taneuh di Shinagawa-ku, Tokyo.Galur MK493-CF1 kabentuk miselium stromal well-branched.Urutan parsial gén RNA ribosom 16S (1422 bp) ditangtukeun.Galur ieu pisan sarupa S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: galur has, 99,93%).Dumasar kana hasil ieu, ditangtukeun yén galur ieu raket patalina jeung galur tipe S. werraensis.Kituna, urang samentara ngaranna galur ieu S. werraensis MK493-CF1.S. werraensis ISP 5486T ogé ngahasilkeun sanyawa bioaktif anu sarua.Kusabab aya sakedik panalungtikan awal pikeun meunangkeun produk alami tina mikroorganisme ieu, panalungtikan kimiawi salajengna dilaksanakeun.Sanggeus budidaya S. werraensis MK493-CF1 dina médium sa'ir ku fermentasi solid-state dina 30 ° C salila 14 poé, médium ieu sasari jeung 50% EtOH.60 ml sampel dikeringkan untuk memperoleh 59,5 mg ekstrak kasar.Ekstrak atah ieu subjected kana fase sabalikna HPLC pikeun masihan N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1, ngaranna coumamonamide, 36,0 mg).Jumlah total 1 kira-kira 60% tina ekstrak atah.Ku alatan éta, urang mutuskeun pikeun diajar sacara rinci sipat kumamotoamide 1.
Coumamonamide 1 mangrupakeun bubuk amorf bodas jeung spéktrométri massa resolusi luhur (HRESIMS) confirms C6H8N2O2 (Gbr. 1).Fragmén pirol anu diganti C2 tina sanyawa ieu dicirikeun ku δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH dina spéktrum 1H NMR: 4.5 Hz , H-5) jeung δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6), sarta spéktrum 13C NMR nembongkeun ayana opat atom karbon sp2.Ayana gugus amida dina posisi C2 ditaksir ku korelasi HMBC tina proton C-3 ka karbonil amida dina δC 161.1.Sajaba ti éta, 1 H jeung 13 C NMR puncak dina δH 4.10 (3H, S) jeung δC 68.3 nunjukkeun ayana gugus N-méthoxy dina molekul.Sanajan posisi bener tina grup methoxy teu acan ditangtukeun maké analisis spéktroskopi kayaning spéktroskopi béda ditingkatkeun jeung nuclear Overhauser singketan (NOEDF), N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide jadi sanyawa calon munggaran.
Pikeun nangtukeun struktur bener tina 1, a sintésis total dipigawé (Gbr. 2a).Perlakuan 2-aminopyridine 2 sadia komersil kalawan m-CPBA nyababkeun N-oksida 3 pakait dina ngahasilkeun kuantitatif.Saatos 2-aminoazidation of 2, réaksi siklokondensasi anu dijelaskeun ku Abramovich dilaksanakeun dina bénzéna dina suhu 90 ° C pikeun kéngingkeun 1-hidroksi-1H-pyrrole-2-carbonitrile 5 anu dipikahoyong dina gram.Laju 60% (dua tahapan).15,16.Métilasi sareng hidrolisis 4 teras masihan asam 1-metoksi-1H-pirol-2-karboksilat (disebut "asam cumotonic", 6) dina ngahasilkeun anu saé (70%, dua léngkah).Tungtungna, amidasi ngaliwatan asam klorida panengah 6 ngagunakeun amonia cai masihan Kumamoto amida 1 dina 98% ngahasilkeun.Sadaya data spéktral anu disintésis 1 sami sareng terasing 1, ku kituna struktur 1 ditangtukeun;
Sintésis umum sareng analisa kagiatan biologis urbenamide sareng asam urbenic.(a) Total sintésis amida Kumamoto.(b) Bibit Arabidopsis Columbia (Col) tipe liar umur tujuh dinten ditanam dina piring Murashige sareng Skoog (MS) anu ngandung coumamonamide 6 atanapi coumamonamide 1 dina konsentrasi anu dituduhkeun.Skala bar = 1 cm.
Kahiji, urang ditaksir kagiatan biologis urbenamide sareng perantarana pikeun kamampuanana pikeun ngamodulasi kamekaran pepelakan.Kami nambihan rupa-rupa konsentrasi ursmonamide 1 atanapi asam ursmonic 6 kana medium MS agar sareng bibit Arabidopsis thaliana dibudidayakan dina medium ieu.Assays ieu némbongkeun yén konsentrasi luhur (500 μM) tina 6 ngahambat tumuwuhna akar (Gbr. 2b).Salajengna, urang ngahasilkeun rupa-rupa turunan ku ngagentos posisi N1 tina 6 sareng ngalaksanakeun studi hubungan struktur-aktivitas dina éta (prosés sintésis analog dijelaskeun dina Émbaran Pendukung (SI)).Bibit Arabidopsis ditanam dina medium anu ngandung 50 μM turunan asam ursonic, sareng panjang akar diukur.sakumaha ditémbongkeun dina gambar.Ditémbongkeun saperti dina Gambar 3a, b, jeung S1, asam kuumamo boga panjang béda tina ranté alkoksi linier (9, 10, 11, 12, jeung 13) atawa ranté alkoksi badag (15, 16, jeung 17) dina posisi N1.Turunan nunjukkeun inhibisi signifikan tina tumuwuhna akar.Salaku tambahan, urang mendakan yén aplikasi 200 μM 10, 11, atanapi 17 ngahambat pengecambahan (Gbr. 3c sareng S2).
Ulikan ngeunaan hubungan struktur-aktivitas amida Kumamoto sareng sanyawa anu aya hubunganana.(a) Skéma struktur jeung sintésis analog.(b) Kuantifikasi panjang akar bibit umur 7 dinten anu dipelak dina medium MS kalayan atanapi tanpa turunan coumamonamide 50 μM.Tanda bintang nunjukkeun béda anu signifikan sareng perlakuan sham (uji t, kc<0.05).n>18. Data ditémbongkeun salaku mean ± SD.nt hartina "henteu diuji" sabab leuwih ti 50% siki teu berkecambah.(c) Kuantifikasi laju pengecambahan siki anu diolah diinkubasi salami 7 dinten dina medium MS kalayan atanapi tanpa 200 μM coumamonamide sareng sanyawa anu aya hubunganana.Tanda bintang nunjukkeun béda anu signifikan sareng perlakuan palsu (uji chi-kuadrat).n=96.
Narikna, tambahan ranté samping alkil leuwih panjang batan C9 ngurangan aktivitas inhibitory, nunjukkeun yén sanyawa nu patali asam kumamotoic merlukeun ranté samping tina ukuran nu tangtu pikeun némbongkeun aktivitas biologis maranéhanana.
Kusabab analisis hubungan struktur-aktivitas némbongkeun yén C9 ieu dirobah jadi asam ursonic jeung turunan nonyloxy asam ursonic (satuluyna disebut KAND 11) nya éta inhibitor tumuwuh tutuwuhan paling éféktif, urang ngalaksanakeun hiji characterization leuwih detil rupa KAND 11. Treatment of Arabidopsis kalawan 50 μM KAND 11 ampir sakabéhna nyegah pengecambahan, sedengkeun konsentrasi handap (40, 30, 20, atawa 10 μM) tina KAND 11 ngahambat tumuwuhna akar dina dosis-gumantung ragam (Gbr. 4a, b).Pikeun nguji naha KAND 11 mangaruhan viability meristem akar, urang nalungtik akar meristems patri ku propidium iodide (PI) jeung ukuran aréa meristem diukur.Ukuran meristem bibit anu ditumbuhkeun dina medium anu ngandung 25 μM KAND-11 nyaéta 151,1 ± 32,5 μm, sedengkeun ukuran meristem bibit anu tumuwuh dina medium kontrol anu ngandung DMSO nyaéta 264,7 ± 30,8 μm (Gbr. 4c, d). , nu nunjukkeun yén KAND-11 restores aktivitas sélular.nyebarkeun.Méristem akar.Luyu jeung ieu, perlakuan KAND 11 ngurangan jumlah spidol division sél CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS sinyal dina akar meristem (Gbr. 4e) 17.Hasil ieu nunjukkeun yén KAND 11 ngahambat pertumbuhan akar ku cara ngirangan kagiatan proliferasi sél.
Analisis pangaruh ngahambat turunan asam urbenonik (turunan urbenyloxy) dina kamekaran.(a) 7-dinten-lami liar-tipe Col bibit tumuwuh dina pelat MS kalawan konsentrasi dituduhkeun KAND 11. Skala bar = 1 cm.(b) Kuantifikasi panjang akar.Hurup nunjukkeun béda anu signifikan (tés Tukey HSD, p<0.05).n>16. Data ditémbongkeun salaku mean ± SD.(c) mikroskop Confocal propidium iodida-patri liar-tipe Col akar tumuwuh dina pelat MS kalayan atawa tanpa 25 μM KAND 11. Kurung bodas nunjukkeun akar meristem.Skala bar = 100 µm.(d) Kuantifikasi ukuran meristem akar (n = 10 nepi ka 11).Bédana statistik ditangtukeun ngagunakeun t-test (kc<0.05).Bar ngagambarkeun ukuran rata-rata meristem.(e) Mikroskop kontras interferensi diferensial (DIC) tina meristem akar anu ngandung konstruk CDKB2;1pro: CDKB2;1-GUS diwarnaan sareng diwarnaan dina bibit umur 5 dinten anu tumbuh dina pelat MS nganggo atanapi henteu nganggo uji KAND 25 µM.
Fitotoksik KAND 11 diuji satuluyna ngagunakeun tutuwuhan dikotil séjén, bako (Nicotiana tabacum), jeung organisme model tutuwuhan darat utama, liverwort (Marchantia polymorpha).Saperti dina kasus Arabidopsis, bibit bako SR-1 tumuwuh dina medium ngandung 25 μM KAND 11 ngahasilkeun akar pondok (Gbr. 5a).Salaku tambahan, 40 tina 48 siki berkecambah dina piring anu ngandung 200 μM KAND 11, sedengkeun sadaya 48 siki berkecambah dina média anu diolah, nunjukkeun yén konsentrasi KAND anu langkung ageung signifikan (p<0.05;chi test -square) ngahambat pengecambahan bako.(Gbr. 5b).Sajaba ti éta, konsentrasi KAND 11 nu ngahambat tumuwuhna baktéri dina liverwort éta sarupa konsentrasi éféktif dina Arabidopsis (Gbr. 5c).Hasil ieu nunjukkeun yén KAND 11 bisa ngahambat tumuwuhna rupa-rupa tutuwuhan.Urang teras nalungtik kamungkinan sitotoksisitas tina sanyawa anu aya hubunganana sareng monoamide dina organisme sanés, nyaéta sél HeLa manusa sareng galur Escherichia coli DH5α, masing-masing salaku wawakil sél sato sareng baktéri anu langkung luhur.Dina runtuyan assays proliferasi sél, urang katalungtik yén coumamonamide 1, asam coumamonamidic 6, sarta KAND 11 teu mangaruhan tumuwuhna sél HeLa atawa E. coli dina konsentrasi 100 μM (Gbr. 5d, e).
Inhibisi pertumbuhan KAND 11 dina organisme non-Arabidopsis.(a) Bibit bako tipe liar SR-1 umur dua minggu ditanam dina pelat MS anu diposisikan vertikal ngandung 25 μM KAND 11. (b) Bibit bako tipe liar SR-1 umur dua minggu ditanam dina posisi horizontal. Pelat MS ngandung 200 μM KAND 11. (c) Dua-minggu-lami liar-tipe tak-1 liverwort kuncup tumuwuh dina pelat Gamborg B5 kalawan konsentrasi dituduhkeun KAND 11. Panah beureum nunjukkeun spora nu eureun tumuwuh dina dua minggu inkubasi. jaman.(d) Assay proliferasi sél sél HeLa.Jumlah sél giat diukur dina interval waktu tetep ngagunakeun kit cacah sél 8 (Dojindo).Salaku kontrol, sél HeLa dirawat kalayan 5 μg / ml actinomycin D (Act D), anu ngahambat transkripsi polimérase RNA sareng nyababkeun maot sél.Analisis dilakukeun dina rangkep tilu.(e) uji proliferasi sél E. coli.Pertumbuhan E. coli dianalisis ku cara ngukur OD600.Salaku kontrol, sél dirawat kalayan 50 μg / ml ampicillin (Amp), anu ngahambat sintésis témbok sél baktéri.Analisis dilakukeun dina rangkep tilu.
Pikeun decipher mékanisme aksi sitotoksisitas disababkeun ku sanyawa nu patali uramide, urang dianalisis deui turunan asam urbenic kalawan épék inhibitory sedeng.sakumaha ditémbongkeun dina gambar.Ditémbongkeun saperti dina Gambar 2b, 6a, bibit tumuwuh dina piring agar ngandung konsentrasi luhur (200 μM) asam urmotonic 6 ngahasilkeun akar pondok tur melengkung kénca (θ = - 23.7 ± 6.1), sedengkeun bibit tumuwuh dina medium kontrol, bibit ngahasilkeun akar ampir lempeng (θ = – 3.8 ± 7.1).Tumuwuhna serong karakteristik ieu dipikanyaho hasil tina disfungsi mikrotubulus kortikal14,18.Konsisten jeung Pananjung ieu, anu microtubule-destabilizing ubar disopyramide na oryzalin ngainduksi root sarupa cara ngadengdekkeun dina kaayaan tumuwuh urang (Gbr. 2b, 6a).Dina waktos anu sami, urang nguji turunan asam urmotonat sareng milih sababaraha di antarana anu, dina konsentrasi anu tangtu, ngainduksi kamekaran akar serong.Sanyawa 8, 9, jeung 15 robah arah tumuwuhna akar dina 75 μM, 50 μM, jeung 40 μM, masing-masing, nunjukkeun yén sanyawa ieu éféktif bisa destabilize microtubule (Gbr. 2b, 6a).Kami ogé nguji turunan asam ursolat anu paling kuat, KAND 11, dina konsentrasi anu langkung handap (15 µM) sareng mendakan yén aplikasi KAND 11 ngahambat pertumbuhan akar sareng arah pertumbuhan akar henteu rata, sanaos condong miring ka kénca ( Gambar C3)..Kusabab konsentrasi luhur ubar microtubule-destabilizing kadang ngahambat tumuwuhna tutuwuhan tinimbang ngabalukarkeun cara ngadengdekkeun akar, urang salajengna ditaksir kamungkinan yén KAND 11 mangaruhan microtubules ku observasi microtubules cortical dina sél épidermis akar.Imunohistokimia ngagunakeun antibodi anti-β-tubulin dina sél épidermis akar seedling diperlakukeun kalayan 25 μM KAND 11 némbongkeun ilangna ampir kabéh microtubules cortical dina sél épidermis dina zone elongation (Gbr. 6b).Hasil ieu nunjukkeun yén asam kumamotonat sareng turunanana tindakan langsung atanapi henteu langsung dina mikrotubulus pikeun ngaganggu aranjeunna sareng yén sanyawa ieu mangrupikeun sambetan mikrotubulus énggal.
Asam Ursonic sareng turunanna ngarobih mikrotubulus kortikal dina Arabidopsis thaliana.(a) Sudut inclination akar diukur ku ayana rupa-rupa turunan asam urmotonic dina konsentrasi anu dituduhkeun.Balukar tina dua sanyawa anu dipikanyaho ngahambat mikrotubulus: disopyramide sareng oryzalin ogé dianalisis.Inset nunjukkeun standar anu dianggo pikeun ngukur sudut kamekaran akar.Tanda bintang nunjukkeun béda anu signifikan sareng perlakuan sham (uji t, kc<0.05).n>19. Skala bar = 1 cm.(b) Mikrotubulus kortikal dina sél épidermis dina zona elongasi.Mikrotubulus dina akar Arabidopsis Col tipe liar anu tumbuh dina pelat MS nganggo atanapi tanpa 25 μM KAND 11 ditingali ku pewarnaan imunohistokimia ngagunakeun antibodi primér β-tubulin sareng antibodi sékundér konjugasi Alexa Fluor.Skala bar = 10 µm.(c) Struktur mitosis mikrotubulus dina meristem akar.Mikrotubulus divisualisasikan dengan pewarnaan imunohistokimia.Struktur mitosis, kaasup zona prophase, spindles, sarta phragmoplasts, diitung tina gambar confocal.Panah nunjukkeun struktur mikrotubulus mitosis.Tanda bintang nunjukkeun béda anu signifikan sareng perlakuan sham (uji t, kc<0.05).n>9. Skala bar = 50 µm.
Sanajan Ursa mibanda kamampuhan pikeun ngaganggu fungsi mikrotubulus, mékanisme aksi na diperkirakeun béda ti agén depolymerizing microtubule has.Contona, konsentrasi luhur agén depolymerizing microtubule kayaning disopyramide na oryzalin induksi ékspansi anisotropic sél épidermis, sedengkeun KAND 11 henteu.Salaku tambahan, ko-aplikasi KAND 11 sareng disopyramide nyababkeun réspon pertumbuhan akar anu ngainduksi disopyramide sareng inhibisi pertumbuhan anu ngainduksi KAND 11 dititénan (Gbr. S4).Urang ogé dianalisis respon tina disopyramide hypersensitive 1-1 (phs1-1) mutant mun KAND 11. phs1-1 ngabogaan non-canonical tubulin kinase mutasi titik sarta ngahasilkeun akar pondok lamun dirawat kalayan disopyramide9,20.phs1-1 bibit mutant tumuwuh dina medium agar ngandung KAND 11 miboga akar pondok sarupa nu tumuwuh dina disopyramid (gbr. S5).
Sajaba ti éta, kami niténan struktur microtubule mitosis, kayaning zona prophase, spindles, sarta phragmoplasts, dina meristem akar bibit dirawat kalayan KAND 11. Konsisten jeung observasi pikeun CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, panurunan signifikan dina. jumlah microtubulus mitosis ieu observasi (Gbr. 6c).
Pikeun ciri sitotoksisitas KAND 11 dina résolusi subsélular, urang ngarawat sél gantung bako BY-2 kalayan KAND 11 sareng niténan résponna.Urang mimiti ditambahkeun KAND 11 mun BY-2 sél nganyatakeun TagRFP-TUA6, nu fluorescently labél microtubules, pikeun assess efek KAND 11 on microtubules cortical.Kapadetan mikrotubulus kortikal ditaksir nganggo analisis gambar, anu ngitung persentase piksel sitoskeletal diantara piksel sitoplasma.Hasil assay némbongkeun yén sanggeus perlakuan jeung 50 μM atawa 100 μM KAND 11 salila 1 jam, dénsitas turun nyata ka 0.94 ± 0.74% atawa 0.23 ± 0.28% masing-masing, sedengkeun dénsitas sél dirawat kalayan DMSO, amounted ka 1.61 ± 0.34. % (Gbr. 7a).Hasil ieu konsisten jeung observasi dina Arabidopsis yén perlakuan KAND 11 induces depolymerization of microtubules cortical (Gbr. 6b).Kami ogé nalungtik garis BY-2 sareng filamén aktin anu dilabélan GFP-ABD saatos perlakuan kalayan konsentrasi KAND 11 anu sami sareng ningali yén perlakuan KAND 11 ngaganggu filamén aktin.Perlakuan jeung 50 μM atanapi 100 μM KAND 11 pikeun 1 h nyata ngurangan dénsitas filamén aktin mun 1.20 ± 0.62% atawa 0.61 ± 0.26% masing-masing, sedengkeun dénsitas dina sél DMSO-diperlakukeun éta 1.69 ± 0.51% (Gbr. 0.52).7b).Hasil ieu kontras sareng épék propyzamide, anu henteu mangaruhan filamén aktin, sareng latrunculin B, depolymerizer aktin anu henteu mangaruhan mikrotubulus (SI Gambar S6).Salaku tambahan, perlakuan sareng coumamonamide 1, asam coumamonamide 6, atanapi KAND 11 henteu mangaruhan mikrotubulus dina sél HeLa (SI Gambar S7).Ku kituna, mékanisme Peta KAND 11 dipercaya béda ti nu disruptors sitoskeleton dipikawanoh.Salaku tambahan, pengamatan mikroskopis sél BY-2 anu dirawat kalayan KAND 11 ngungkabkeun awal maot sél nalika perlakuan KAND 11 sareng nunjukkeun yén proporsi sél paéh anu diwarnaan biru Evans henteu ningkat sacara signifikan saatos 30 mnt tina perlakuan KAND 11, sedengkeun. sanggeus 90 menit perlakuan jeung 50 μM atawa 100 μM KAND, jumlah sél maot ngaronjat masing-masing 43,7% atawa 80,1% (Gbr. 7c).Dicokot babarengan, data ieu nunjukkeun yén novél asam ursolic turunan KAND 11 mangrupakeun inhibitor cytoskeletal husus tutuwuhan jeung mékanisme aksi saméméhna kanyahoan.
KAND mangaruhan mikrotubulus kortikal, filamén aktin, sareng viability sél BY-2 bako.(a) Visualisasi mikrotubulus kortikal dina sél BY-2 ku ayana TagRFP-TUA6.Sél BY-2 dirawat kalayan KAND 11 (50 μM atanapi 100 μM) atanapi DMSO ditaliti ku mikroskop confocal.Kapadetan microtubule cortical diitung tina micrographs 25 sél bebas.Hurup nunjukkeun béda anu signifikan (tés Tukey HSD, p<0.05).Skala bar = 10 µm.(b) filamén aktin cortical dina sél BY-2 visualized ku ayana GFP-ABD2.Sél BY-2 dirawat kalayan KAND 11 (50 μM atanapi 100 μM) atanapi DMSO ditaliti ku mikroskop confocal.Kapadetan filamén aktin kortikal diitung tina mikrograf 25 sél mandiri.Hurup nunjukkeun béda anu signifikan (tés Tukey HSD, p<0.05).Skala bar = 10 µm.(c) Observasi sél BY-2 maot ku Evans staining biru.Sél BY-2 anu dirawat kalayan KAND 11 (50 μM atanapi 100 μM) atanapi DMSO ditaliti ku mikroskop lapangan terang.n=3.Skala bar = 100 µm.
Papanggihan sareng aplikasi produk alami anyar parantos nyababkeun kamajuan anu signifikan dina sagala rupa aspék kahirupan manusa, kalebet ubar sareng tatanén.Panalungtikan sajarah geus dilaksanakeun pikeun meunangkeun sanyawa mangpaat tina sumber daya alam.Khususna, actinomycetes dipikanyaho mangpaat salaku antibiotik antiparasit pikeun nematoda alatan kamampuhna pikeun ngahasilkeun rupa-rupa métabolit sekundér kayaning avermectin, sanyawa timah ivermectin jeung bleomycin sarta turunan na, dipaké medicinally salaku agén antikanker21,22.Kitu ogé, rupa-rupa sanyawa herbisida geus kapanggih tina actinomycetes, sababaraha nu geus dipaké komersil1,23.Ku alatan éta, analisis metabolit actinomycete pikeun ngasingkeun produk alam jeung aktivitas biologis dipikahoyong dianggap strategi éféktif.Dina ulikan ieu, urang manggihan sanyawa anyar, coumamonamide, ti S. werraensis tur hasil disintésis eta.Asam Ursonic mangrupikeun perantara sintétik tina urbenamide sareng turunanna.Éta tiasa nyababkeun akar curling karakteristik, nunjukkeun kagiatan herbisida sedeng dugi ka kuat, sareng langsung atanapi henteu langsung ngaruksak mikrotubulus pepelakan.Sanajan kitu, mékanisme Peta asam urmotonic bisa jadi béda ti sambetan microtubule aya, saprak KAND 11 ogé disrupts filamén aktin sarta ngabalukarkeun maot sél, suggesting mékanisme pangaturan dimana asam urmotonic sarta turunan mangaruhan rupa-rupa struktur sitoskeletal..
Karakterisasi lengkep asam urbenonik bakal ngabantosan langkung ngartos mékanisme tindakan asam urbenonik.Khususna, tujuan salajengna nyaéta pikeun meunteun kamampuan asam ursonic pikeun ngabeungkeut kana mikrotubulus anu diréduksi pikeun ngabedakeun asam ursonik sareng turunanna langsung kana mikrotubulus sareng depolymerize aranjeunna, atanapi naha tindakanna nyababkeun destabilisasi mikrotubulus.Sajaba ti éta, dina kasus dimana microtubules teu udagan langsung, identifying situs aksi jeung target molekular asam ursonic dina sél tutuwuhan bakal mantuan leuwih ngartos sipat sanyawa patali jeung mungkin cara pikeun ngaronjatkeun aktivitas herbicidal.Uji bioaktivitas kami ngungkabkeun kamampuan sitotoksik unik asam ursonic dina kamekaran pepelakan sapertos Arabidopsis thaliana, bako sareng liverwort, sedengkeun sél E. coli atanapi HeLa henteu kapangaruhan.Saeutik atawa euweuh karacunan kana sél sato mangrupa kaunggulan tina turunan asam ursonic lamun aranjeunna dikembangkeun salaku herbisida pikeun pamakéan dina widang tatanén kabuka.Mémang, saprak mikrotubulus mangrupakeun struktur umum dina eukariota, inhibisi selektif maranéhanana dina tutuwuhan mangrupakeun sarat konci pikeun herbisida.Contona, propyzamide, agén depolymerizing microtubule nu langsung ngabeungkeut tubulin sarta ngahambat polimérisasi, dipaké salaku herbisida alatan karacunan low kana sél sato24.Kontras jeung disopyramide, bénzamides patali boga spésifisitas target béda.Salian mikrotubulus tutuwuhan, RH-4032 atanapi benzoxamide ogé ngahambat mikrotubulus sél sato atanapi oomycetes, masing-masing, sareng zalilamide dianggo salaku fungisida kusabab phytotoxicity na rendah25,26,27.Beruang nu karek kapanggih jeung turunan na némbongkeun sitotoksisitas selektif ngalawan tutuwuhan, tapi perlu dicatet yén modifikasi salajengna bisa ngarobah spésifisitas target maranéhanana, berpotensi nyadiakeun turunan tambahan pikeun ngadalikeun fungi pathogenic atawa oomycetes.
Sipat unik asam urbenonik sareng turunanana mangpaat pikeun pangwangunanana salaku herbisida sareng dianggo salaku alat panalungtikan.Pentingna sitoskeleton dina ngadalikeun bentuk sél tutuwuhan geus dipikawanoh lega.Panaliti saméméhna nunjukkeun yén pepelakan parantos mekarkeun mékanisme kompleks organisasi mikrotubulus kortikal ku cara ngadalikeun dinamika mikrotubulus pikeun ngontrol morfogenesis.Sajumlah badag molekul jawab pangaturan aktivitas microtubule geus pasti, sarta panalungtikan patali masih lumangsung3,4,28.Pamahaman urang ayeuna ngeunaan dinamika microtubule dina sél tutuwuhan teu pinuh ngajelaskeun mékanisme organisasi microtubule cortical.Contona, sanajan duanana disopyramide jeung oryzalin bisa depolymerize microtubulus, disopyramide ngabalukarkeun distorsi akar parna bari oryzalin miboga éfék rélatif hampang.Leuwih ti éta, mutasi dina tubulin, nu stabilizes microtubules, ogé ngabalukarkeun dextrorotation dina akar, sedengkeun paclitaxel, nu ogé stabilizes dinamika microtubule, henteu.Ku alatan éta, ngulik sareng ngaidentipikasi target molekular asam ursolat kedah masihan wawasan énggal ngeunaan pangaturan mikrotubulus kortikal pepelakan.Kitu ogé, babandingan hareup bahan kimia anu éféktif dina promosi tumuwuhna menyimpang, kayaning disopyramide, sarta bahan kimia kirang éféktif, kayaning oryzalin atawa asam kumamotoric, bakal nyadiakeun clues kumaha tumuwuhna menyimpang lumangsung.
Di sisi séjén, rearrangements cytoskeletal patali pertahanan kamungkinan sejen pikeun ngajelaskeun cytotoxicity asam ursonic.Inféksi patogén atawa asupna hiji elicitor kana sél tutuwuhan kadang ngabalukarkeun karuksakan sitoskeleton sarta maot sél saterusna29.Salaku conto, cryptoxanthin turunan oomycete parantos dilaporkeun ngaganggu mikrotubulus sareng filamén aktin sateuacan maot sél bako, sami sareng anu lumangsung kalayan perlakuan KAND30,31.Kasaruaan antara réspon pertahanan sareng réspon sélular anu disababkeun ku asam ursonic nyababkeun urang hipotésis yén aranjeunna memicu prosés sélular umum, sanaos pangaruh asam ursonic anu langkung gancang sareng langkung kuat tibatan cryptoxanthin.Sanajan kitu, studi geus ditémbongkeun yén gangguan filamén aktin promotes maot sél spontan, nu teu salawasna dibarengan ku gangguan microtubule29.Sajaba ti éta, tetep katingal naha boh patogén atawa elicitor ngabalukarkeun tumuwuhna akar menyimpang, sakumaha turunan asam ursonic.Ku kituna, pangaweruh molekular linking réspon pertahanan jeung sitoskeleton mangrupa masalah pikaresepeun pikeun kajawab.Ku eksploitasi ayana sanyawa beurat molekul low patali jeung asam ursonic, kitu ogé sauntuyan turunan kalawan potencies varying, aranjeunna bisa nyadiakeun kasempetan pikeun sasaran mékanisme sélular kanyahoan.
Dihijikeun, kapanggihna jeung aplikasi sanyawa anyar nu modulate dinamika microtubule bakal nyadiakeun métode kuat pikeun alamat mékanisme molekular kompléks kaayaan tekad bentuk sél tutuwuhan.Dina kontéks ieu, asam urmotonic sanyawa anu nembé dikembangkeun, anu mangaruhan mikrotubulus sareng filamén aktin sareng nyababkeun maot sél, tiasa masihan kasempetan pikeun ngémutan hubungan antara kontrol mikrotubulus sareng mékanisme sanés ieu.Ku kituna, analisis kimiawi jeung biologis ngagunakeun asam urbenonic bakal nulungan urang ngartos mékanisme pangaturan molekular nu ngadalikeun sitoskeleton tutuwuhan.
Inoculate S. werraensis MK493-CF1 ke dalam labu Erlenmeyer baffled 500 mL berisi 110 mL medium biji yang terdiri dari 2% (w/v) galaktosa, 2% (w/v) Essence paste, 1% ( w/v) komposisi Bacto .-kedelai (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (w / v) sari jagong (KOGOSTCH Co., Ltd., Jepang), 0,2% (w / v) (NH4) 2SO4 jeung 0,2% CaCO3 dina cai deionized.(pH 7,4 sateuacan sterilisasi).Kultur siki diinkubasi dina shaker rotary (180 rpm) dina suhu 27 ° C salami 2 dinten.budidaya produksi via fermentasi solid state.Kultur siki (7 ml) dialihkeun kana labu K-1 500 ml anu ngandung 40 g medium produksi anu diwangun ku 15 g sa'ir dipencet (MUSO Co., Ltd., Jepang) sareng 25 g cai deionisasi (pH henteu disaluyukeun. sateuacan sterilisasi).).Fermentasi dilaksanakeun dina suhu 30 ° C dina poék salami 14 dinten.Bahan fermentasi diekstrak nganggo 40 ml / botol EtOH sareng disentrifugasi (1500 g, 4 ° C, 10 mnt).Supernatan kultur (60 ml) diekstrak kalayan campuran 10% MeOH/EtOAc.Lapisan organik diuapkeun dina tekanan anu diréduksi pikeun kéngingkeun résidu (59,5 mg), anu ditaksir ku HPLC kalayan élusi gradién (0-10 menit: 90%) dina kolom fase sabalikna (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × panjangna 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 menit: 90% H2O/CH3CN nepi ka 70% H2O/CH3CN (gradién), 35–45 menit: 90% H2O/EtOH, 45–155 menit: 90% H2O / EtOH mun 100% EtOH (gradién (gradién), 155-200 mnt: 100% EtOH) dina laju aliran 1,5 ml / mnt, coumamonamide (1, 36,0 mg) ieu diisolasi salaku bubuk amorf bodas.
Kumamotoamide(1);1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H).), 4,08 (s, 3H);13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ nilai diitung: 141,0659, nilai diukur: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1538 cm
Siki Columbia (Col-0) dicandak ti Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) kalayan idin pikeun dianggo panalungtikan.Siki Col-0 disebarkeun sareng dijaga dina kaayaan laboratorium urang sareng dianggo salaku pepelakan Arabidopsis tipe liar.Bibit Arabidopsis disterilisasi permukaan sareng dibudidayakeun dina medium Murashige sareng Skoog anu satengah kakuatan anu ngandung 2% sukrosa (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (w/v) 2-(4-morpholino) asam etanesulfonic (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical). ).) jeung 1,5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, dina 23 °C jeung cahaya konstan.Bibit mutant phs1-1 disayogikeun ku T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology).
Bibit galur SR-1 disayogikeun ku T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) sareng dianggo salaku pepelakan bako liar.Siki bako disterilkeun permukaanna sareng direndam dina cai steril salami tilu wengi kanggo ngamajukeun pengecambahan, teras disimpen dina larutan satengah kakuatan anu ngandung 2% sukrosa, 0,05% (w / v) MES, sareng 0,8% karét gellan (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige.sarta sedeng Skoog) kalawan pH 5,7 sarta inkubasi dina 23 ° C dina lampu konstan.
Galur Tak-1 disayogikeun ku T. Kohchi (Universitas Kyoto) sareng dianggo salaku unit ékspérimén standar pikeun ulikan liverwort.Gemma dicandak tina pepelakan budidaya anu disterilisasi teras dilapis dina medium Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) anu ngandung 1% sukrosa sareng 0,3% karét gellan sareng diinkubasi dina suhu 23 ° C dina lampu kontinyu.
Sél bako BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Caang Konéng 2) disadiakeun ku S. Hasezawa (Universitas Tokyo).Sél BY-2 éncér 95 kali lipet dina médium Linsmeier sareng Skoog anu dirobih sareng ditambah mingguan ku asam 2,4-diklorofenoksiacétat 32.Suspénsi sél dicampurkeun dina shaker Rotary dina 130 rpm dina 27 ° C dina poék.Ngumbah sél ku 10 kali volume sedeng seger jeung resuspend dina medium sarua.BY-2 garis sél transgenik stably nganyatakeun spidol microtubule TagRFP-TUA6 atawa spidol filamén aktin GFP-ABD2 handapeun promoter virus mosaic kembang engkol 35S dihasilkeun sakumaha digambarkeun33,34,35.Garis sél ieu tiasa dijaga sareng disingkronkeun nganggo prosedur anu sami sareng anu dianggo pikeun garis sél BY-2 asli.
Sél HeLa dibudidayakeun dina medium Eagle's Modified Dulbecco (DMEM) (Life Technologies) ditambah ku 10% sérum bovine fetal, 1.2 U / ml pénisilin, sareng 1.2 μg / ml streptomycin dina incubator 37 ° C kalayan 5% CO2.
Sadaya percobaan anu dijelaskeun dina naskah ieu dilaksanakeun saluyu sareng peraturan sareng pedoman biosafety Jepang.
Sanyawa leyur dina dimétil sulfoksida (DMSO; Fujifilm Wako Murni Kimia) salaku solusi stock na diluted dina MS sedeng pikeun Arabidopsis jeung bako atawa Gamborg B5 sedeng pikeun liverwort.Pikeun uji inhibisi pertumbuhan akar, langkung ti 10 siki per piring ditaburkeun dina medium agar-agar anu ngandung sanyawa anu dituduhkeun atanapi DMSO.Sikina inkubasi dina chamber tumuwuh salila 7 poé.Bibit dipoto sareng panjang akar diukur.Pikeun uji pengecambahan Arabidopsis, 48 siki per piring ditaburkeun dina medium agar-agar anu ngandung sanyawa 200 μM atanapi DMSO.Siki Arabidopsis dipelak dina kamar tumuwuh sarta jumlah bibit anu berkecambah diitung 7 poé sanggeus pengecambahan (dag).Pikeun uji pengecambahan bako, 24 siki per piring ditaburkeun dina medium agar anu ngandung 200 μM KAND atanapi DMSO.Sikina bako dipelak dina kamar tumuwuh sarta jumlah bibit anu berkecambah diitung sanggeus 14 poé.Pikeun uji inhibisi pertumbuhan liverwort, 9 émbrio tina unggal pelat dilapis dina medium agar anu ngandung konsentrasi KAND atanapi DMSO anu dituduhkeun sareng diinkubasi dina kamar kamekaran salami 14 dinten.
Anggo bibit anu diwarnaan ku 5 mg/ml propidium iodide (PI) pikeun ngabayangkeun organisasi meristem akar.Sinyal PI dititénan ku mikroskop fluoresensi ngagunakeun TCS SPE confocal laser scanning mikroskop (Leica Microsystems).
Pewarnaan histokimia akar kalayan β-glucuronidase (GUS) dilakukeun dumasar kana protokol anu dijelaskeun ku Malami sareng Benfey36.Bibit dibereskeun dina 90% aseton sapeuting, diwarnaan ku 0,5 mg / ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic acid dina panyangga GUS salami 1 jam sareng disimpen dina larutan kloraldehida terhidrasi.(8 g chloral hydrate, 2 ml cai jeung 1 ml gliserol) jeung observasi ku diferensial interferensi kontras mikroskop ngagunakeun mikroskop Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Sudut akar diukur dina bibit umur 7 dinten anu tumbuh dina piring anu vertikal.Ukur sudut akar tina arah véktor gravitasi sakumaha anu dijelaskeun dina léngkah 6.
Susunan mikrotubulus kortikal dititénan sakumaha anu dijelaskeun, kalayan modifikasi minor kana protokol 37.Antibodi anti-β-tubulin (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) sareng Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) dianggo salaku antibodi primér sareng sekundér dina éncér 1:1000 sareng 1:100, masing-masing.Gambar fluoresensi dicandak nganggo mikroskop scanning laser confocal TCS SPE (Leica Microsystems).Kéngingkeun gambar Z-tumpukan sareng jieun proyéksi inténsitas maksimum numutkeun parentah produsén.
Assay proliferasi sél HeLa dipigawé maké Cell Counting Kit 8 (Dojindo) nurutkeun parentah produsén urang.
Tumuwuhna E. coli DH5α dianalisis ku cara ngukur dénsitas sél dina kultur ngagunakeun spéktrofotométer dina 600 nm (OD600).
Organisasi sitoskeletal dina sél BY-2 transgenik dititénan nganggo mikroskop fluoresensi anu dilengkepan alat scanning confocal CSU-X1 (Yokogawa) sareng kaméra sCMOS (Zyla, Andor Technology).Dénsitas sitoskeletal ditaksir ku analisa gambar, anu ngitung persentase piksel sitoskeletal diantara piksel sitoplasma dina gambar confocal nganggo parangkat lunak ImageJ sakumaha anu dijelaskeun38,39.
Pikeun ngadeteksi maot sél dina sél BY-2, hiji aliquot tina gantung sél ieu incubated kalawan 0,05% Evans biru keur 10 menit dina suhu kamar.Selektif Evans ngawarnaan biru sél paéh gumantung kana ékstrusi ngalelep tina sél giat ku mémbran plasma gembleng40.Sél patri dititénan maké mikroskop widang caang (BX53, Olympus).
Sél HeLa anu tumuwuh di DMEM supplemented kalawan 10% FBS dina incubator humidified dina 37 ° C jeung 5% CO2.Sél dirawat kalayan 100 μM KAND 11, asam kumamonamat 6, kumamonamide 1, 100 ng / ml colcemid (Gibco), atanapi 100 ng / ml Nocodmaze (Sigma) salami 6 jam dina 37 ° C.Sél dilereskeun sareng MetOH salami 10 mnt teras nganggo asétat salami 5 mnt dina suhu kamar.Sél tetep diinkubasi ku antibodi primér β-tubulin (1D4A4, Proteintech: 66240-1) éncér dina 0,5% BSA / PBS salami 2 jam, dikumbah 3 kali nganggo TBST, teras diinkubasi ku antibodi kambing Alexa Fluor.488 1 jam.- Mouse IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) jeung 15 ng / ml 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) diluted dina 0,5% BSA / PBS.Saatos ngumbah sareng TBST tilu kali, sél anu patri dititénan dina mikroskop Nikon Eclipse Ti-E inverted.Gambar dicandak nganggo kaméra CCD Hamamatsu ORCA-R2 anu tiis ngagunakeun parangkat lunak MetaMorph (Alat Molekul).
waktos pos: Jun-17-2024