Hatur nuhun parantos nganjang ka Nature.com. Vérsi browser anu anjeun anggo gaduh dukungan CSS anu terbatas. Pikeun hasil anu pangsaéna, kami nyarankeun anjeun nganggo vérsi browser anu langkung énggal (atanapi nonaktipkeun Modeu Kompatibilitas dina Internet Explorer). Samentawis waktos, pikeun mastikeun dukungan anu terus-terusan, kami nunjukkeun situs ieu tanpa gaya atanapi JavaScript.
Kapanggihna sareng panggunaan produk alami anu mangpaat tiasa ngabantosan ningkatkeun kahirupan manusa. Bahan kimia anu ngahambat kamekaran pepelakan seueur dianggo salaku herbisida pikeun ngontrol gulma. Kusabab kabutuhan pikeun nganggo rupa-rupa jinis herbisida, aya kabutuhan pikeun ngaidentipikasi sanyawa kalayan mékanisme aksi anyar. Dina panilitian ieu, kami mendakan sanyawa N-alkoxypyrrole anyar, coumamonamide, tina Streptomyces werraensis MK493-CF1 sareng ngadegkeun prosés sintésis anu lengkep. Ngaliwatan uji aktivitas biologis, kami mendakan yén asam urs-monoamat mangrupikeun zat antara sintétis tina urs-monoamid sareng poténsialinhibitor pertumbuhan pepelakanSalian ti éta, kami parantos ngembangkeun rupa-rupa turunan asam urbenonik, kalebet turunan urbenyloksi (UDA), anu gaduh aktivitas herbisida anu luhur tanpa mangaruhan négatif kana kamekaran sél HeLa. Kami ogé mendakan yén turunan asam urmotonik ngaganggu mikrotubulus pepelakan; salian ti éta, KAND mangaruhan filamén aktin sareng nyababkeun maotna sél; Éfék multifaset ieu béda ti inhibitor mikrotubulus anu dipikanyaho sareng nunjukkeun mékanisme aksi anyar pikeun asam ursonat, anu ngagambarkeun kaunggulan penting dina pamekaran herbisida anyar.
Kapanggihna sareng aplikasi praktis produk alami anu mangpaat sareng turunanana mangrupikeun cara pikeun ningkatkeun kualitas kahirupan manusa. Métabolit sékundér anu dihasilkeun ku mikroorganisme, pepelakan sareng serangga parantos nyababkeun kamajuan anu ageung dina widang kadokteran sareng tatanén. Seueur antibiotik sareng ubar anti-leukemia parantos dikembangkeun tina produk alami. Salian ti éta, rupa-rupa jinispestisida, fungisida sareng herbisida diekstrak tina produk alami ieu pikeun dianggo dina tatanén. Khususna, herbisida pangendali gulma mangrupikeun alat anu penting pikeun ningkatkeun hasil panén dina tatanén modéren, sareng rupa-rupa jinis sanyawa parantos dianggo sacara komersil. Sababaraha prosés sélular dina pepelakan, sapertos fotosintésis, métabolisme asam amino, sintésis témbok sél, pangaturan mitosis, sinyal fitohormon, atanapi sintésis protéin, dianggap target khas herbisida. Sanyawa anu ngahambat fungsi mikrotubulus mangrupikeun kelas herbisida umum anu mangaruhan kamekaran pepelakan ku cara mangaruhan pangaturan mitosis2.
Mikrotubulus nyaéta komponén sitoskeleton sareng seueur disimpen dina sél eukariotik. Héterodimer tubulin diwangun ku α-tubulin sareng β-tubulin anu ngabentuk protofilamen mikrotubulus linier, kalayan 13 protofilamen ngabentuk struktur silinder. Mikrotubulus maénkeun sababaraha peran dina sél tutuwuhan, kalebet nangtukeun bentuk sél, divisi sél, sareng transportasi intraseluler3,4. Sél tutuwuhan ngandung mikrotubulus di handapeun mémbran plasma interfase, sareng anu disebut mikrotubulus kortikal ieu dipercaya ngontrol organisasi mikrofibril selulosa ngalangkungan pangaturan kompleks sintase selulosa4,5. Mikrotubulus kortikal sél épidermal akar, anu aya di zona pemanjangan gancang ujung akar, ayana di sisi, sareng mikrofiber selulosa nuturkeun mikrotubulus ieu sareng ngawatesan arah ékspansi sél, sahingga ngamajukeun pemanjangan sél anisotropik. Ku alatan éta, fungsi mikrotubulus raket patalina sareng morfologi tutuwuhan. Substitusi asam amino dina gén anu ngodekeun tubulin nyababkeun miringna susunan mikrotubulus kortikal sareng kamekaran sisi kénca atanapi katuhu dina Arabidopsis 6,7. Nya kitu deui, mutasi dina protéin anu aya hubunganana sareng mikrotubulus anu ngatur dinamika mikrotubulus ogé tiasa nyababkeun kamekaran akar anu distorsi8,9,10,11,12,13. Salaku tambahan, pangobatan nganggo herbisida anu ngaganggu mikrotubulus sapertos disopyramide, ogé katelah pretilachlor, ogé nyababkeun kamekaran akar miring sisi kénca14. Data ieu nunjukkeun yén pangaturan fungsi mikrotubulus anu tepat penting pisan pikeun nangtukeun arah kamekaran pepelakan.
Rupa-rupa jinis inhibitor mikrotubulus parantos kapanggih, sareng ubar ieu parantos masihan kontribusi anu signifikan pikeun panilitian sitoskeletal, ogé pikeun tatanén sareng ubar2. Khususna, oryzalin, sanyawa dinitroanilin, disopyramide, sanyawa anu aya hubunganana sareng benzamide, sareng analogna tiasa ngahambat fungsi mikrotubulus sareng ku kituna ngahambat kamekaran pepelakan. Ku alatan éta, éta seueur dianggo salaku herbisida. Nanging, kumargi mikrotubulus mangrupikeun komponén penting sél pepelakan sareng sato, kaseueuran inhibitor mikrotubulus sitotoksik pikeun duanana jinis sél. Ku alatan éta, sanaos utilitasna dikenal salaku herbisida, sajumlah agén antimikrotubulus anu kawates dianggo pikeun tujuan praktis.
Streptomyces nyaéta genus kulawarga Streptomyces, anu ngawengku baktéri aerobik, gram-positip, filamén sareng dikenal sacara lega kusabab kamampuanna pikeun ngahasilkeun rupa-rupa metabolit sekundér. Ku alatan éta, éta dianggap salah sahiji sumber produk alami aktif biologis anu paling penting. Dina panilitian ayeuna, kami mendakan sanyawa anyar anu disebut coumamonamide, anu diisolasi tina Streptomyces werraensis MK493-CF1 sareng S. werraensis ISP 5486. Ngagunakeun analisis spéktral sareng analisis spéktral lengkep, struktur coumamonamide dicirikeun sareng rorongkong N-alkoxypyrrole anu unik ditangtukeun. sintésis. Asam Ursmonat, zat antara sintétis tina ursmonoamide sareng turunanana, kapanggih ngahambat kamekaran sareng pengecambahan pepelakan modél anu populér Arabidopsis thaliana. Dina panilitian hubungan struktur-aktivitas, kami mendakan yén sanyawa sareng C9 anu dimodifikasi janten asam ursonic, anu disebut turunan nonyloxy tina asam ursonic (KAND), sacara signifikan ningkatkeun pangaruh inhibisi kana kamekaran sareng pengecambahan. Anu penting, inhibitor pertumbuhan pepelakan anu nembé kapanggih ogé mangaruhan pertumbuhan bako sareng lumut ati sareng henteu sitotoksik pikeun baktéri atanapi sél HeLa. Leuwih ti éta, sababaraha turunan asam urmotonat ngainduksi fenotipe akar anu distorsi, anu nunjukkeun yén turunan ieu sacara langsung atanapi henteu langsung mangaruhan mikrotubulus. Saluyu sareng ideu ieu, pangamatan kami ngeunaan mikrotubulus anu dilabélan boh sacara imunohistokimia atanapi protéin fluoresensi nunjukkeun yén perlakuan KAND ngadépolimerisasi mikrotubulus. Salaku tambahan, perlakuan ku turunan asam kumamotonat ngaganggu mikrofilamen aktin. Ku kituna, kami parantos mendakan inhibitor pertumbuhan pepelakan énggal anu mékanisme aksi unikna ngalibatkeun karusakan sitoskeleton.
Galur MK493-CF1 diisolasi tina taneuh di Shinagawa-ku, Tokyo. Galur MK493-CF1 ngabentuk miselium stromal anu bercabang kalawan saé. Urutan parsial tina gén RNA ribosom 16S (1422 bp) ditangtukeun. Galur ieu ampir sami sareng S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: galur has, 99,93%). Dumasar kana hasil ieu, ditangtukeun yén galur ieu raket patalina sareng galur tipe S. werraensis. Ku alatan éta, sacara samentara kami masihan nami galur ieu S. werraensis MK493-CF1. S. werraensis ISP 5486T ogé ngahasilkeun sanyawa bioaktif anu sami. Kusabab saeutik panalungtikan awal pikeun kéngingkeun produk alami tina mikroorganisme ieu, panalungtikan kimia salajengna dilaksanakeun. Saatos budidaya S. werraensis MK493-CF1 dina média gandum ku fermentasi padet dina suhu 30°C salami 14 dinten, média diekstrak nganggo 50% EtOH. 60 ml sampel dikeringkeun pikeun kéngingkeun 59,5 mg ekstrak kasar. Ekstrak kasar dikenakeun kana HPLC fase terbalik pikeun ngahasilkeun N-metoksi-1H-pirol-2-karboksamida (1, dingaranan kuumamonamida, 36,0 mg). Jumlah total 1 nyaéta sakitar 60% tina ekstrak kasar. Ku alatan éta, kami mutuskeun pikeun nalungtik sacara rinci sipat-sipat kumamotoamida 1.
Kumamonamida 1 nyaéta bubuk amorf bodas sareng spéktrométri massa résolusi luhur (HRESIMS) mastikeun C6H8N2O2 (Gambar 1). Fragmen pirola anu disubstitusi C2 tina sanyawa ieu dicirikeun ku δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH dina spéktrum 1H NMR: 4,5 Hz, H-5) sareng δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), sareng spéktrum 13C NMR nunjukkeun ayana opat atom karbon sp2. Ayana gugus amida dina posisi C2 dipeunteun ku korélasi HMBC tina proton C-3 kana karbon karbonil amida dina δC 161,1. Salian ti éta, puncak 1 H sareng 13 C NMR dina δH 4.10 (3H, S) sareng δC 68.3 nunjukkeun ayana gugus N-métoksi dina molekul. Sanaos posisi anu leres tina gugus métoksi tacan ditangtukeun nganggo analisis spéktroskopi sapertos spéktroskopi béda anu ditingkatkeun sareng singgetan Overhauser nuklir (NOEDF), N-métoksi-1H-pirol-2-karboksamida janten sanyawa calon anu munggaran.
Pikeun nangtukeun struktur 1 anu leres, sintésis total dilaksanakeun (Gambar 2a). Pangolahan 2-aminopyridin 2 anu sayogi sacara komersil nganggo m-CPBA ngahasilkeun N-oksida 3 anu saluyu dina hasil kuantitatif. Saatos 2-aminoazidasi 2, réaksi siklokondensasi anu dijelaskeun ku Abramovich dilaksanakeun dina bénzéna dina suhu 90°C pikeun kéngingkeun 1-hidroksi-1H-pirol-2-karbonitril 5 anu dipikahoyong dina gram. Laju 60% (dua tahapan). 15,16. Metilasi sareng hidrolisis 4 teras masihan asam 1-métoksi-1H-pirol-2-karboksilat (disebat "asam kumotonat", 6) dina hasil anu saé (70%, dua léngkah). Pamungkas, amidasi ngalangkungan antara asam klorida 6 nganggo amonia cai masihan amida Kumamoto 1 dina hasil 98%. Sadaya data spéktral tina 1 anu disintésis sami sareng 1 anu diisolasi, janten struktur 1 ditangtukeun;
Sintésis umum sareng analisis aktivitas biologis urbenamide sareng asam urbenat. (a) Sintésis total amida Kumamoto. (b) Bibit Arabidopsis Columbia (Col) tipe liar umur tujuh dinten dipelak dina pelat Murashige sareng Skoog (MS) anu ngandung coumamonamide 6 atanapi coumamonamide 1 dina konsentrasi anu dituduhkeun. Skala bar = 1 cm.
Mimitina, urang meunteun kagiatan biologis urbenamide sareng zat antara na pikeun kamampuanna pikeun ngamodulasi kamekaran pepelakan. Urang nambihan rupa-rupa konsentrasi ursmonamide 1 atanapi asam ursmonat 6 kana média agar MS sareng bibit Arabidopsis thaliana anu dibudidayakeun dina média ieu. Uji ieu nunjukkeun yén konsentrasi anu luhur (500 μM) tina 6 ngahambat kamekaran akar (Gambar 2b). Salajengna, urang ngahasilkeun rupa-rupa turunan ku cara ngagantikeun posisi N1 tina 6 sareng ngalaksanakeun studi hubungan struktur-aktivitas dina éta (prosés sintésis analog dijelaskeun dina Inpormasi Pendukung (SI)). Bibit Arabidopsis dipelak dina média anu ngandung 50 μM turunan asam ursonat, sareng panjang akar diukur sapertos anu dipidangkeun dina gambar. Sakumaha anu dipidangkeun dina Gambar 3a, b, sareng S1, asam coumamo gaduh panjang ranté alkoksi linier (9, 10, 11, 12, sareng 13) atanapi ranté alkoksi ageung (15, 16, sareng 17) anu béda dina posisi N1. Turunan-turunan éta nunjukkeun inhibisi anu signifikan kana kamekaran akar. Salian ti éta, urang mendakan yén aplikasi 200 μM 10, 11, atanapi 17 ngahalangan pengecambahan (Gambar 3c sareng S2).
Ulikan ngeunaan hubungan struktur-aktivitas amida Kumamoto sareng sanyawa anu aya hubunganana. (a) Skéma struktur sareng sintésis analog. (b) Kuantifikasi panjang akar bibit umur 7 dinten anu dipelak dina média MS kalayan atanapi tanpa turunan kumamonamide 50 μM. Asterisk nunjukkeun béda anu signifikan sareng perlakuan palsu (uji t, p< 0.05). n>18. Data dipidangkeun salaku rata-rata ± SD. nt hartina "teu diuji" sabab leuwih ti 50% siki teu berkecambah. (c) Kuantifikasi laju pengecambahan siki anu dirawat diinkubasi salami 7 dinten dina média MS kalayan atanapi tanpa 200 μM coumamonamide sareng sanyawa anu aya hubunganana. Tanda asterisk nunjukkeun béda anu signifikan sareng perlakuan palsu (uji chi-kuadrat). n=96.
Anu pikaresepeun nyaéta, panambahan ranté sisi alkil anu langkung panjang tibatan C9 ngirangan aktivitas inhibisi, nunjukkeun yén sanyawa anu aya hubunganana sareng asam kumamotoat meryogikeun ranté sisi anu ukuranana tangtu pikeun nunjukkeun aktivitas biologisna.
Kusabab analisis hubungan struktur-aktivitas nunjukkeun yén C9 dirobih jadi asam ursonat sareng turunan noniloksi tina asam ursonat (salajengna disebut KAND 11) mangrupikeun inhibitor pertumbuhan pepelakan anu paling efektif, kami ngalaksanakeun karakterisasi KAND 11 anu langkung rinci. Perawatan Arabidopsis nganggo 50 μM KAND 11 ampir sagemblengna nyegah pengecambahan, sedengkeun konsentrasi anu langkung handap (40, 30, 20, atanapi 10 μM) tina KAND 11 ngahalangan pertumbuhan akar ku cara anu gumantung kana dosis (Gambar 4a, b). Pikeun nguji naha KAND 11 mangaruhan viabilitas meristem akar, kami nalungtik meristem akar anu diwarnaan ku propidium iodida (PI) sareng ngukur ukuran daérah meristem. Ukuran meristem bibit anu dipelak dina média anu ngandung 25 μM KAND-11 nyaéta 151,1 ± 32,5 μm, sedengkeun ukuran meristem bibit anu dipelak dina média kontrol anu ngandung DMSO nyaéta 264,7 ± 30,8 μm (Gambar 4c, d), anu nunjukkeun yén KAND-11 mulangkeun aktivitas sél. nyebarkeun. Meristem akar. Saluyu sareng ieu, perlakuan KAND 11 ngirangan jumlah sinyal CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS dina meristem akar (Gambar 4e) 17. Hasil ieu nunjukkeun yén KAND 11 ngahambat kamekaran akar ku cara ngirangan aktivitas proliferasi sél.
Analisis pangaruh inhibisi turunan asam urbenonat (turunan urbenyloxy) kana kamekaran. (a) Bibit Col tipe liar umur 7 dinten anu dipelak dina pelat MS kalayan konsentrasi KAND 11 anu dituduhkeun. Skala bar = 1 cm. (b) Kuantifikasi panjang akar. Hurup nunjukkeun béda anu signifikan (uji Tukey HSD, p< 0.05). n>16. Data dipidangkeun salaku rata-rata ± SD. (c) Mikroskopi confocal tina akar Col tipe liar anu diwarnaan propidium iodida anu dipelak dina pelat MS kalayan atanapi tanpa 25 μM KAND 11. Kurung bodas nunjukkeun meristem akar. Bilah skala = 100 µm. (d) Kuantifikasi ukuran meristem akar (n = 10 dugi ka 11). Béda statistik ditangtukeun nganggo uji-t (p< 0,05). Batang-batang éta ngagambarkeun ukuran rata-rata meristem. (e) Mikroskopi kontras interferensi diferensial (DIC) tina meristem akar anu ngandung konstruksi CDKB2; 1pro: CDKB2; 1-GUS diwarnaan sareng diwarnaan dina bibit umur 5 dinten anu dipelak dina pelat MS kalayan atanapi tanpa uji KAND 25 µM.
Fitotoksisitas KAND 11 salajengna diuji nganggo pepelakan dikotil anu sanés, bako (Nicotiana tabacum), sareng organisme modél pepelakan darat utama, liverwort (Marchantia polymorpha). Sapertos dina kasus Arabidopsis, bibit bako SR-1 anu dipelak dina média anu ngandung 25 μM KAND 11 ngahasilkeun akar anu langkung pondok (Gambar 5a). Salaku tambahan, 40 tina 48 siki berkecambah dina piring anu ngandung 200 μM KAND 11, sedengkeun sadaya 48 siki berkecambah dina média anu dirawat tiruan, nunjukkeun yén konsentrasi KAND anu langkung luhur signifikan (p< 0,05; uji chi -kuadrat) ngahalangan pengecambahan bako. (Gambar 5b). Salian ti éta, konsentrasi KAND 11 anu ngahalangan kamekaran baktéri dina lumut ati sami sareng konsentrasi efektif dina Arabidopsis (Gambar 5c). Hasil ieu nunjukkeun yén KAND 11 tiasa ngahalangan kamekaran rupa-rupa pepelakan. Teras kami nalungtik kamungkinan sitotoksisitas sanyawa anu aya hubunganana sareng monoamida biruang dina organisme sanés, nyaéta sél HeLa manusa sareng galur Escherichia coli DH5α, salaku wawakil sél sato sareng baktéri anu langkung luhur. Dina runtuyan uji proliferasi sél, kami niténan yén coumamonamide 1, asam coumamonamidat 6, sareng KAND 11 henteu mangaruhan kamekaran sél HeLa atanapi E. coli dina konsentrasi 100 μM (Gambar 5d, e).
Inhibisi kamekaran KAND 11 dina organisme non-Arabidopsis. (a) Bibit bako SR-1 tipe liar umur dua minggu dipelak dina pelat MS anu diposisikan sacara vertikal anu ngandung 25 μM KAND 11. (b) Bibit bako SR-1 tipe liar umur dua minggu dipelak dina pelat MS anu diposisikan sacara horizontal anu ngandung 200 μM KAND 11. (c) Kuncup lumut ati Tak-1 tipe liar umur dua minggu anu dipelak dina pelat Gamborg B5 kalayan konsentrasi KAND 11 anu dituduhkeun. Panah beureum nunjukkeun spora anu eureun tumuwuh dina période inkubasi dua minggu. (d) Uji proliferasi sél sél HeLa. Jumlah sél anu hirup diukur dina interval waktu anu tetep nganggo kit cacah sél 8 (Dojindo). Salaku kontrol, sél HeLa dirawat ku 5 μg/ml actinomycin D (Act D), anu ngahambat transkripsi RNA polimérase sareng nyababkeun maot sél. Analisis dilakukeun dina tilu kali lipat. (e) Uji proliferasi sél E. coli. Tumuwuhna E. coli dianalisis ku ngukur OD600. Salaku kontrol, sél dirawat ku ampisilin (Amp) 50 μg/ml, anu ngahalangan sintésis témbok sél baktéri. Analisis dilakukeun tilu kali.
Pikeun ngadekripsi mékanisme aksi sitotoksisitas anu disababkeun ku sanyawa anu aya hubunganana sareng uramida, kami nganalisis deui turunan asam urbenat kalayan épék inhibisi sedeng, sapertos anu dipidangkeun dina gambar. Sakumaha anu dipidangkeun dina Gambar 2b, 6a, bibit anu dipelak dina pelat agar anu ngandung konsentrasi anu luhur (200 μM) asam urmotonat 6 ngahasilkeun akar anu langkung pondok sareng melengkung ka kénca (θ = – 23,7 ± 6,1), sedengkeun bibit anu dipelak dina média kontrol, bibit ngahasilkeun akar anu ampir lempeng (θ = – 3,8 ± 7,1). Pertumbuhan miring anu khas ieu dipikanyaho hasil tina disfungsi mikrotubulus kortikal14,18. Saluyu sareng panemuan ieu, ubar anu ngadéstabilisasi mikrotubulus disopyramide sareng oryzalin ngainduksi miring akar anu sami dina kaayaan pertumbuhan kami (Gambar 2b, 6a). Dina waktos anu sami, kami nguji turunan asam urmotonat sareng milih sababaraha di antarana anu, dina konsentrasi anu tangtu, ngainduksi pertumbuhan akar miring. Sanyawa 8, 9, sareng 15 ngarobih arah kamekaran akar dina 75 μM, 50 μM, sareng 40 μM, masing-masing, nunjukkeun yén sanyawa ieu tiasa sacara efektif ngadéstabilisasi mikrotubulus (Gambar 2b, 6a). Kami ogé nguji turunan asam ursolat anu paling kuat, KAND 11, dina konsentrasi anu langkung handap (15 µM) sareng mendakan yén aplikasi KAND 11 ngahambat kamekaran akar sareng arah kamekaran akar henteu rata, sanaos condong miring ka kénca (Gambar C3). Kusabab konsentrasi anu langkung luhur tina ubar anu ngadéstabilisasi mikrotubulus kadang-kadang ngahambat kamekaran pepelakan tinimbang nyababkeun miringna akar, kami salajengna meunteun kamungkinan yén KAND 11 mangaruhan mikrotubulus ku cara niténan mikrotubulus kortikal dina sél épidermal akar. Imunohistokimia nganggo antibodi anti-β-tubulin dina sél épidermal akar bibit anu dirawat ku 25 μM KAND 11 nunjukkeun leungitna ampir sadaya mikrotubulus kortikal dina sél épidermal dina zona elongasi (Gambar 6b). Hasil ieu nunjukkeun yén asam kumamotonat sareng turunanna meta sacara langsung atanapi teu langsung kana mikrotubulus pikeun ngaganggu éta sareng yén sanyawa ieu mangrupikeun inhibitor mikrotubulus anyar.
Asam ursonik sareng turunanana ngarobih mikrotubulus kortikal dina Arabidopsis thaliana. (a) Sudut inklinasi akar diukur kalayan ayana rupa-rupa turunan asam urmotonat dina konsentrasi anu dituduhkeun. Pangaruh dua sanyawa anu dipikanyaho ngahambat mikrotubulus: disopiramid sareng oryzalin ogé dianalisis. Sisipan nunjukkeun standar anu dianggo pikeun ngukur sudut kamekaran akar. Asterisk nunjukkeun béda anu signifikan sareng perlakuan palsu (uji t, p< 0.05). n>19. Bilah skala = 1 cm. (b) Mikrotubulus kortikal dina sél épidermal dina zona elongasi. Mikrotubulus dina akar Arabidopsis Col tipe liar anu dipelak dina pelat MS kalayan atanapi tanpa 25 μM KAND 11 divisualisasikeun ku pewarnaan imunohistokimia nganggo antibodi primér β-tubulin sareng antibodi sekundér konjugasi Alexa Fluor. Bilah skala = 10 µm. (c) Struktur mitosis mikrotubulus dina meristem akar. Mikrotubulus divisualisasikeun nganggo pewarnaan imunohistokimia. Struktur mitosis, kalebet zona profase, spindel, sareng phragmoplas, diitung tina gambar confocal. Panah nunjukkeun struktur mikrotubulus mitosis. Tanda asterisk nunjukkeun béda anu signifikan sareng perlakuan palsu (uji t, p< 0.05). n>9. Batang skala = 50 µm.
Sanaos Ursa gaduh kamampuan pikeun ngaganggu fungsi mikrotubulus, mékanisme aksina diperkirakeun béda ti agén depolimerisasi mikrotubulus has. Salaku conto, konsentrasi agén depolimerisasi mikrotubulus anu langkung luhur sapertos disopyramid sareng oryzalin ngainduksi ékspansi anisotropik sél épidermal, sedengkeun KAND 11 henteu. Salaku tambahan, aplikasi ko-KAND 11 sareng disopyramid ngahasilkeun réspon pertumbuhan akar anu diinduksi disopyramid sareng inhibisi pertumbuhan anu diinduksi KAND 11 dititénan (Gambar S4). Kami ogé nganalisis réspon mutan disopyramid 1-1 (phs1-1) hipersensitif ka KAND 11. phs1-1 gaduh mutasi titik tubulin kinase non-kanonik sareng ngahasilkeun akar anu langkung pondok nalika dirawat ku disopyramid9,20. Bibit mutan phs1-1 anu dipelak dina média agar anu ngandung KAND 11 gaduh akar anu langkung pondok sami sareng anu dipelak dina disopyramid (gambar S5).
Salian ti éta, urang niténan struktur mikrotubulus mitosis, sapertos zona profase, spindel, sareng phragmoplas, dina meristem akar bibit anu dirawat ku KAND 11. Saluyu sareng observasi pikeun CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, panurunan anu signifikan dina jumlah mikrotubulus mitosis dititénan (Gambar .6c).
Pikeun ngacirikeun sitotoksisitas KAND 11 dina résolusi subsélular, urang ngubaran sél suspénsi BY-2 bako nganggo KAND 11 sareng niténan résponna. Mimitina urang nambihan KAND 11 kana sél BY-2 anu ngébréhkeun TagRFP-TUA6, anu sacara fluoresensi ngalabel mikrotubulus, pikeun meunteun pangaruh KAND 11 kana mikrotubulus kortikal. Kapadetan mikrotubulus kortikal ditaksir nganggo analisis gambar, anu ngitung persentase piksel sitoskeletal di antara piksel sitoplasma. Hasil uji nunjukkeun yén saatos dirawat nganggo 50 μM atanapi 100 μM KAND 11 salami 1 jam, kapadetanna turun sacara signifikan janten 0,94 ± 0,74% atanapi 0,23 ± 0,28%, masing-masing, sedengkeun kapadetan sél anu dirawat nganggo DMSO, nyaéta 1,61 ± 0,34% (Gambar 7a). Hasil ieu saluyu sareng observasi dina Arabidopsis yén pangobatan KAND 11 ngainduksi depolimerisasi mikrotubulus kortikal (Gambar 6b). Kami ogé nalungtik garis BY-2 nganggo filamén aktin anu dilabélan GFP-ABD saatos dirawat ku konsentrasi KAND 11 anu sami sareng niténan yén perawatan KAND 11 ngaganggu filamén aktin. Perawatan nganggo 50 μM atanapi 100 μM KAND 11 salami 1 jam sacara signifikan ngirangan kapadetan filamén aktin janten 1,20 ± 0,62% atanapi 0,61 ± 0,26%, masing-masing, sedengkeun kapadetan dina sél anu dirawat DMSO nyaéta 1,69 ± 0,51% (Gambar 2). 7b). Hasil ieu kontras sareng pangaruh propyzamide, anu henteu mangaruhan filamén aktin, sareng latrunculin B, depolymerizer aktin anu henteu mangaruhan mikrotubulus (Gambar SI S6). Salaku tambahan, perawatan nganggo coumamonamide 1, asam coumamonamide 6, atanapi KAND 11 henteu mangaruhan mikrotubulus dina sél HeLa (Gambar SI S7). Ku kituna, mékanisme aksi KAND 11 dipercaya béda ti anu dipikanyaho salaku disruptor sitoskeleton. Salian ti éta, observasi mikroskopis kami ngeunaan sél BY-2 anu dirawat ku KAND 11 ngungkabkeun awal maotna sél salami pangobatan KAND 11 sareng nunjukkeun yén proporsi sél paéh anu diwarnaan biru Evans henteu ningkat sacara signifikan saatos 30 menit pangobatan KAND 11, sedengkeun saatos 90 menit pangobatan ku 50 μM atanapi 100 μM KAND, jumlah sél paéh ningkat janten 43,7% atanapi 80,1%, masing-masing (Gambar 7c). Sacara gembleng, data ieu nunjukkeun yén turunan asam ursolat anyar KAND 11 mangrupikeun inhibitor sitoskeleton spésifik pepelakan kalayan mékanisme aksi anu sateuacanna teu dipikanyaho.
KAND mangaruhan mikrotubulus kortikal, filamén aktin, sareng viabilitas sél BY-2 bako. (a) Visualisasi mikrotubulus kortikal dina sél BY-2 kalayan ayana TagRFP-TUA6. Sél BY-2 anu dirawat ku KAND 11 (50 μM atanapi 100 μM) atanapi DMSO ditalungtik ku mikroskop confocal. Kapadetan mikrotubulus kortikal diitung tina mikrograf 25 sél mandiri. Hurup nunjukkeun béda anu signifikan (tés Tukey HSD, p< 0,05). Skala bar = 10 µm. (b) Filamén aktin kortikal dina sél BY-2 divisualisasikeun ku ayana GFP-ABD2. Sél BY-2 anu dirawat ku KAND 11 (50 μM atanapi 100 μM) atanapi DMSO dipariksa ku mikroskop confocal. Kapadatan filamén aktin kortikal diitung tina mikrograf 25 sél mandiri. Hurup nunjukkeun béda anu signifikan (tés Tukey HSD, p< 0,05). Bilah skala = 10 µm. (c) Observasi sél BY-2 anu paéh ku cara ngawarnaan biru Evans. Sél BY-2 anu dirawat ku KAND 11 (50 μM atanapi 100 μM) atanapi DMSO dipariksa ku mikroskop medan caang. n=3. Bilah skala = 100 µm.
Kapanggihna sareng aplikasi produk alami anyar parantos nyababkeun kamajuan anu signifikan dina sababaraha aspék kahirupan manusa, kalebet ubar sareng tatanén. Panalungtikan sajarah parantos dilaksanakeun pikeun kéngingkeun sanyawa anu mangpaat tina sumber daya alam. Khususna, aktinomisetes dipikanyaho mangpaat salaku antibiotik antiparasit pikeun nematoda kusabab kamampuanna pikeun ngahasilkeun rupa-rupa metabolit sekundér sapertos avermectin, sanyawa utama ivermectin sareng bleomycin sareng turunanana, anu dianggo sacara ubar salaku agén antikanker21,22. Kitu ogé, rupa-rupa sanyawa herbisida parantos kapanggih tina aktinomisetes, sababaraha di antarana parantos dianggo sacara komersil1,23. Ku alatan éta, analisis metabolit aktinomisetes pikeun ngasingkeun produk alami kalayan kagiatan biologis anu dipikahoyong dianggap strategi anu efektif. Dina panilitian ieu, kami mendakan sanyawa anyar, coumamonamide, tina S. werraensis sareng suksés nyintésisna. Asam ursonic mangrupikeun zat antara sintétis tina urbenamide sareng turunanana. Éta tiasa nyababkeun akar anu melengkung, nunjukkeun kagiatan herbisida anu sedeng dugi ka kuat, sareng langsung atanapi henteu langsung ngaruksak mikrotubulus pepelakan. Nanging, mékanisme aksi asam urmotonat tiasa bénten sareng inhibitor mikrotubulus anu tos aya, kumargi KAND 11 ogé ngaganggu filamén aktin sareng nyababkeun maotna sél, nunjukkeun mékanisme pangaturan dimana asam urmotonat sareng turunanana mangaruhan rupa-rupa struktur sitoskeletal.
Karakterisasi asam urbenonat anu langkung lengkep bakal ngabantosan pikeun langkung ngartos mékanisme aksi asam urbenonat. Khususna, tujuan salajengna nyaéta pikeun meunteun kamampuan asam ursonat pikeun ngabeungkeut mikrotubulus anu diréduksi pikeun nangtukeun naha asam ursonat sareng turunanana meta langsung kana mikrotubulus sareng ngadépolimerisasina, atanapi naha aksina nyababkeun destabilisasi mikrotubulus. Salaku tambahan, dina kasus dimana mikrotubulus sanés target langsung, ngaidentipikasi tempat aksi sareng target molekuler asam ursonat dina sél pepelakan bakal ngabantosan langkung ngartos sipat-sipat sanyawa anu aya hubunganana sareng cara anu mungkin pikeun ningkatkeun aktivitas herbisida. Uji bioaktivitas kami ngungkabkeun kamampuan sitotoksik anu unik tina asam ursonat kana kamekaran pepelakan sapertos Arabidopsis thaliana, bako sareng lumut ati, sedengkeun sél E. coli atanapi HeLa henteu kapangaruhan. Saeutik atanapi henteu aya toksisitas kana sél sato mangrupikeun kaunggulan turunan asam ursonat upami dikembangkeun salaku herbisida pikeun dianggo di lahan pertanian terbuka. Memang, kumargi mikrotubulus mangrupikeun struktur umum dina eukariota, inhibisi selektifna dina pepelakan mangrupikeun sarat konci pikeun herbisida. Contona, propyzamide, agén depolimerisasi mikrotubulus anu langsung ngabeungkeut tubulin sareng ngahalangan polimérisasi, dianggo salaku herbisida kusabab toksisitasna anu handap pikeun sél sato24. Sabalikna tina disopyramide, benzamida anu aya hubunganana gaduh spésifisitas target anu béda. Salian ti mikrotubulus tutuwuhan, RH-4032 atanapi benzoxamide ogé ngahalangan mikrotubulus sél sato atanapi oomycetes, masing-masing, sareng zalilamide dianggo salaku fungisida kusabab fitotoksisitasna anu handap25,26,27. Beruang anu nembé kapanggih sareng turunanana nunjukkeun sitotoksisitas selektif ngalawan pepelakan, tapi perlu dicatet yén modifikasi salajengna tiasa ngarobih spésifisitas targetna, anu berpotensi nyayogikeun turunan tambahan pikeun ngontrol jamur patogén atanapi oomycetes.
Sipat unik asam urbenonat sareng turunanana mangpaat pikeun pamekaranana salaku herbisida sareng dianggo salaku alat panalungtikan. Pentingna sitoskeleton dina ngontrol bentuk sél tutuwuhan parantos diakui sacara lega. Panilitian sateuacana nunjukkeun yén pepelakan parantos ngembangkeun mékanisme anu rumit tina organisasi mikrotubulus kortikal ku cara ngontrol dinamika mikrotubulus pikeun ngontrol morfogenesis kalayan leres. Sajumlah ageung molekul anu tanggung jawab pikeun pangaturan aktivitas mikrotubulus parantos diidéntifikasi, sareng panilitian anu aya hubunganana masih lumangsung3,4,28. Pamahaman urang ayeuna ngeunaan dinamika mikrotubulus dina sél tutuwuhan henteu sacara lengkep ngajelaskeun mékanisme organisasi mikrotubulus kortikal. Salaku conto, sanaos disopiramid sareng oryzalin tiasa ngadepolimerisasi mikrotubulus, disopiramid nyababkeun distorsi akar anu parah sedengkeun oryzalin gaduh pangaruh anu relatif hampang. Leuwih ti éta, mutasi dina tubulin, anu ngastabilkeun mikrotubulus, ogé nyababkeun dektrorotasi dina akar, sedengkeun paclitaxel, anu ogé ngastabilkeun dinamika mikrotubulus, henteu. Ku alatan éta, nalungtik sareng ngaidentipikasi target molekuler asam ursolat kedah masihan wawasan énggal kana pangaturan mikrotubulus kortikal pepelakan. Kitu ogé, babandingan bahan kimia anu épéktip dina ngamajukeun kamekaran anu distorsi, sapertos disopiramid, sareng bahan kimia anu kirang épéktip, sapertos oryzalin atanapi asam kumamotorik, bakal masihan petunjuk ngeunaan kumaha kamekaran anu distorsi lumangsung.
Di sisi séjén, pangaturan ulang sitoskeleton anu aya hubunganana sareng pertahanan mangrupikeun kamungkinan sanés pikeun ngajelaskeun sitotoksisitas asam ursonic. Infeksi patogén atanapi bubuka elicitor kana sél pepelakan kadang nyababkeun karusakan sitoskeleton sareng maotna sél salajengna29. Salaku conto, cryptoxanthin anu diturunkeun tina oomycete parantos dilaporkeun ngaganggu mikrotubulus sareng filamén aktin sateuacan maotna sél bako, sami sareng anu kajantenan sareng perlakuan KAND30,31. Kamiripan antara réspon pertahanan sareng réspon sélular anu diinduksi ku asam ursonic ngarah urang kana hipotesis yén éta micu prosés sélular umum, sanaos pangaruh asam ursonic anu langkung gancang sareng langkung kuat tibatan cryptoxanthin jelas. Nanging, panilitian parantos nunjukkeun yén gangguan filamén aktin ngamajukeun maotna sél spontan, anu henteu salawasna dibarengan ku gangguan mikrotubulus29. Salaku tambahan, masih kedah ditingali naha patogén atanapi elicitor nyababkeun kamekaran akar anu distorsi, sapertos turunan asam ursonic. Ku kituna, pangaweruh molekuler anu ngaitkeun réspon pertahanan sareng sitoskeleton mangrupikeun masalah anu pikaresepeun pikeun diatasi. Ku cara ngamangpaatkeun ayana sanyawa beurat molekul rendah anu aya hubunganana sareng asam ursonat, ogé rupa-rupa turunan kalayan poténsi anu béda-béda, éta tiasa nyayogikeun kasempetan pikeun narékahan mékanisme sélulér anu teu dipikanyaho.
Sacara gembleng, kapanggihna sareng aplikasi sanyawa énggal anu ngamodulasi dinamika mikrotubulus bakal nyayogikeun metode anu kuat pikeun ngungkulan mékanisme molekuler kompléks anu aya dina dasar nangtukeun bentuk sél tutuwuhan. Dina kontéks ieu, sanyawa asam urmotonat anu nembe dikembangkeun, anu mangaruhan mikrotubulus sareng filamén aktin sareng nyababkeun maotna sél, tiasa nyayogikeun kasempetan pikeun ngadekripsi hubungan antara kontrol mikrotubulus sareng mékanisme sanésna. Ku kituna, analisis kimia sareng biologis nganggo asam urbenonat bakal ngabantosan urang ngartos mékanisme pangaturan molekuler anu ngontrol sitoskeleton tutuwuhan.
Inokulasi S. werraensis MK493-CF1 kana labu Erlenmeyer 500 mL anu ngandung 110 mL média siki anu diwangun ku 2% (w/v) galaktosa, 2% (w/v) pasta ésénsi, 1% (w/v) komposisi Bacto.-kécap (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (w/v) ekstrak jagong (KOGOSTCH Co., Ltd., Jepang), 0,2% (w/v) (NH4)2SO4 sareng 0,2% CaCO3 dina cai deionisasi. (pH 7,4 sateuacan sterilisasi). Kultur siki diinkubasi dina shaker rotary (180 rpm) dina suhu 27°C salami 2 dinten. Budidaya produksi ngalangkungan fermentasi kaayaan padet. Kultur siki (7 ml) dipindahkeun kana labu K-1 500 ml anu ngandung 40 g média produksi anu diwangun ku 15 g gandum anu dipencet (MUSO Co., Ltd., Jepang) sareng 25 g cai deionisasi (pH henteu disaluyukeun sateuacan sterilisasi). Fermentasi dilaksanakeun dina suhu 30°C dina tempat anu poék salami 14 dinten. Bahan fermentasi diekstrak ku 40 ml/botol EtOH teras disentrifugasi (1500 g, 4°C, 10 menit). Supernatan kultur (60 ml) diekstrak ku campuran 10% MeOH/EtOAc. Lapisan organik diuapkeun dina tekanan anu dikirangan pikeun kéngingkeun sésa (59,5 mg), anu dikenakeun HPLC kalayan élusi gradien (0–10 menit: 90%) dina kolom fase tibalik (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × panjang 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 menit: 90% H2O/CH3CN dugi ka 70% H2O/CH3CN (gradien), 35–45 menit: 90% H2O/EtOH, 45–155 menit: 90% H2O/EtOH dugi ka 100% EtOH (gradien (gradien), 155–200 menit: 100% EtOH) dina laju aliran 1,5 ml/mnt, kumamonamide (1, 36,0 mg) diisolasi salaku bubuk amorf bodas.
Kumamotoamide(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H). ), 4,08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ nilai itungan: 141.0659, nilai anu diukur: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Siki Columbia (Col-0) diala ti Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) kalawan idin pikeun panalungtikan. Siki Col-0 dipelak jeung dijaga dina kaayaan laboratorium sarta dipaké salaku tutuwuhan Arabidopsis tipe liar. Siki Arabidopsis disterilisasi permukaan sarta dibudidayakeun dina média Murashige jeung Skoog satengah kakuatan nu ngandung 2% sukrosa (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (w/v) 2-(4-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical). ) jeung 1,5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, dina suhu 23 °C sarta cahaya konstan. Siki mutan phs1-1 disadiakeun ku T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology).
Sikina galur SR-1 disayogikeun ku T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) sareng dianggo salaku pepelakan bako tipe liar. Sikina bako disterilisasi permukaan sareng direndem dina cai steril salami tilu wengi pikeun ningkatkeun pengecambahan, teras disimpen dina larutan satengah kakuatan anu ngandung 2% sukrosa, 0,05% (w/v) MES, sareng 0,8% gellan gum (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige. sareng média Skoog) kalayan pH 5,7 sareng diinkubasi dina suhu 23°C dina cahaya anu konstan.
Galur Tak-1 disayogikeun ku T. Kohchi (Universitas Kyoto) sareng dianggo salaku unit ékspérimén standar pikeun panilitian lumut ati. Gemma diala tina pepelakan budidaya anu disterilisasi teras dilapis dina média Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) anu ngandung 1% sukrosa sareng 0,3% gellan gum sareng diinkubasi dina suhu 23°C dina cahaya kontinyu.
Sél BY-2 bako (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) disayogikeun ku S. Hasezawa (Universitas Tokyo). Sél BY-2 diéncérkeun 95 kali lipat dina média Linsmeier sareng Skoog anu dimodifikasi sareng ditambahan mingguan ku asam 2,4-diklorofenoksiasetat 32. Suspénsi sél dicampur dina shaker rotary dina 130 rpm dina suhu 27°C dina poék. Kumbah sél ku 10 kali volume média seger sareng suspénsikeun deui dina média anu sami. Garis sél transgenik BY-2 anu sacara stabil ngébréhkeun spidol mikrotubulus TagRFP-TUA6 atanapi spidol filamén aktin GFP-ABD2 dina promotor virus mosaik kembang kol 35S dihasilkeun sapertos anu dijelaskeun 33,34,35. Garis sél ieu tiasa dijaga sareng disinkronkeun nganggo prosedur anu sami sareng anu dianggo pikeun garis sél BY-2 asli.
Sél HeLa dikultur dina média Dulbecco's modified Eagle's (DMEM) (Life Technologies) anu ditambahan ku 10% sérum sapi fétal, 1,2 U/ml pénisilin, sareng 1,2 μg/ml streptomisin dina inkubator 37°C kalayan 5% CO2.
Sadaya ékspérimén anu dijelaskeun dina naskah ieu dilaksanakeun saluyu sareng peraturan sareng pedoman biosafety Jepang.
Sanyawa-sanyawa éta dileyurkeun dina dimetil sulfoksida (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) salaku larutan stok teras diéncérkeun dina média MS pikeun Arabidopsis sareng média bako atanapi Gamborg B5 pikeun liverwort. Pikeun uji inhibisi kamekaran akar, langkung ti 10 siki per piring dipelak dina média agar anu ngandung sanyawa anu dituduhkeun atanapi DMSO. Sikina diinkubasi dina rohangan kamekaran salami 7 dinten. Bibit difoto sareng panjang akar diukur. Pikeun uji pengecambahan Arabidopsis, 48 siki per piring dipelak dina média agar anu ngandung 200 μM sanyawa atanapi DMSO. Sikina Arabidopsis dipelak dina rohangan kamekaran sareng jumlah bibit anu berkecambah diitung 7 dinten saatos pengecambahan (dag). Pikeun uji pengecambahan bako, 24 siki per piring dipelak dina média agar anu ngandung 200 μM KAND atanapi DMSO. Sikina bako dipelak dina rohangan kamekaran sareng jumlah bibit anu berkecambah diitung saatos 14 dinten. Pikeun uji inhibisi pertumbuhan lumut ati, 9 embrio ti unggal lempeng ditempatkeun dina média agar anu ngandung konsentrasi KAND atanapi DMSO anu dituduhkeun teras diinkubasi dina ruang pertumbuhan salami 14 dinten.
Anggo bibit anu diwarnaan ku 5 mg/ml propidium iodida (PI) pikeun ngabayangkeun organisasi meristem akar. Sinyal PI dititénan ku mikroskop fluoresensi nganggo mikroskop scanning laser confocal TCS SPE (Leica Microsystems).
Pewarnaan histokimia akar nganggo β-glucuronidase (GUS) dilaksanakeun dumasar kana protokol anu dijelaskeun ku Malami sareng Benfey36. Bibit difiksasi dina 90% aseton sapeuting, diwarnaan ku 0,5 mg/ml 5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-d-asam glukuronat dina buffer GUS salami 1 jam teras disimpen dina larutan kloraldehida terhidrasi. (8 g kloral hidrat, 2 ml cai sareng 1 ml gliserol) teras diamati ku mikroskop kontras interferensi diferensial nganggo mikroskop Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Sudut akar diukur dina bibit umur 7 dinten anu dipelak dina pelat anu ditempatkeun sacara vertikal. Ukur sudut akar tina arah véktor gravitasi sapertos anu dijelaskeun dina léngkah 6.
Susunan mikrotubulus kortikal dititénan sakumaha anu dijelaskeun, kalayan modifikasi minor kana protokol 37. Antibodi anti-β-tubulin (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) sareng Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) dianggo salaku antibodi primér sareng sekundér dina éncér 1:1000 sareng 1:100, masing-masing. Gambar fluoresensi diala nganggo mikroskop scanning laser confocal TCS SPE (Leica Microsystems). Kéngingkeun gambar Z-stack sareng jieun proyéksi inténsitas maksimum numutkeun pitunjuk produsén.
Uji proliferasi sél HeLa dilaksanakeun nganggo Cell Counting Kit 8 (Dojindo) numutkeun pitunjuk ti produsén.
Tumuwuhna E. coli DH5α dianalisis ku cara ngukur kapadetan sél dina kultur nganggo spektrofotometer dina 600 nm (OD600).
Organisasi sitoskeletal dina sél BY-2 transgenik dititénan nganggo mikroskop fluoresensi anu dilengkepan ku alat scan confocal CSU-X1 (Yokogawa) sareng kaméra sCMOS (Zyla, Andor Technology). Kapadetan sitoskeletal ditaksir ku analisis gambar, anu ngitung persentase piksel sitoskeletal di antara piksel sitoplasma dina gambar confocal nganggo parangkat lunak ImageJ sapertos anu dijelaskeun38,39.
Pikeun ngadeteksi maotna sél dina sél BY-2, sajumlah leutik suspénsi sél diinkubasi ku 0,05% Evans blue salami 10 menit dina suhu kamar. Pewarnaan Evans blue selektif sél paéh gumantung kana ékstrusi pewarna tina sél anu hirup ku mémbran plasma anu utuh40. Sél anu diwarnaan dititénan nganggo mikroskop medan caang (BX53, Olympus).
Sél HeLa dipelak dina DMEM anu ditambahan ku 10% FBS dina inkubator anu dilembabkeun dina suhu 37°C sareng 5% CO2. Sél dirawat ku 100 μM KAND 11, asam kumamonamat 6, kumamonamide 1, 100 ng/ml colcemid (Gibco), atanapi 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) salami 6 jam dina suhu 37°C. Sél difiksasi ku MetOH salami 10 menit teras ku asetat salami 5 menit dina suhu kamar. Sél anu difiksasi diinkubasi ku antibodi primér β-tubulin (1D4A4, Proteintech: 66240-1) anu diéncérkeun dina 0,5% BSA/PBS salami 2 jam, dikumbah 3 kali ku TBST, teras diinkubasi ku antibodi embe Alexa Fluor. 488 1 jam. – IgG beurit (Thermo Fisher Scientific: A11001) sareng 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) anu diéncérkeun dina 0,5% BSA/PBS. Saatos dikumbah nganggo TBST tilu kali, sél anu diwarnaan dititénan dina mikroskop tibalik Nikon Eclipse Ti-E. Gambar dicandak nganggo kaméra CCD Hamamatsu ORCA-R2 anu didinginkan nganggo parangkat lunak MetaMorph (Molecular Devices).
Waktos posting: 17-Jun-2024